【摘要】：蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是一種嚴重的腦血管疾病,致死致殘率較高,嚴重威脅著患者生命健康。早期的研究認為SAH導致的遲發(fā)性血管痙攣可能是患者致死致殘的主要原因。最近一項多中心的雙盲臨床試驗研究表明,一種新的內(nèi)皮素受體拮抗劑Clazosentan,能使顱內(nèi)大血管痙攣程度明顯減輕,卻沒有顯著改善神經(jīng)功能預(yù)后,減少患者死亡,這些結(jié)果提示可能存在除了顱內(nèi)血管痙攣以外的其它需要評估的腦損傷機制。目前有一系列的證據(jù)表明,炎癥反應(yīng)在蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)功能損傷中起著重要的作用,并與患者的預(yù)后呈負相關(guān)。最近幾年有研究學者提出了早期腦損傷(early brain injury,EBI)這一新概念,文獻中將其定義為SAH后72小時內(nèi)出現(xiàn)的的急性神經(jīng)系統(tǒng)損傷,包括急性顱內(nèi)壓增高、腦水腫、血腦屏障破壞、神經(jīng)功能障礙等。目前已在動物實驗及臨床研究中證明,免疫炎癥反應(yīng)在SAH后的EBI中起著關(guān)鍵作用,而對于免疫炎癥反應(yīng)信號通路的抑制可能成為SAH患者潛在的治療靶點。TOLL樣受體(toll-like receptors, TLRs)是天然免疫及機體的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRR)之一,在炎癥反應(yīng)和固有免疫中起著關(guān)鍵性的作用。目前已經(jīng)有12種TLRs (TLR1-TLR12)在人類被發(fā)現(xiàn),有研究表明Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)在腦卒中、阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病及帕金森病的免疫炎癥反應(yīng)中起著重要作用。近期有文獻報道SAH后早期TLR4/NF-κB信號通路被激活,并在炎癥反應(yīng)中起著重要作用,而抑制該通路則可明顯減少腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6(interleukin-6, IL-6),白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)和細胞間粘附分子-1(intercelluar adhesion molecule-1, ICAM-1)的釋放,改善神經(jīng)功能障礙并減輕腦損傷,因此TLR4/NF-κB信號通路可能是蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷潛在的治療靶點。高壓氧是一種非侵入性的物理療法,目前被廣泛應(yīng)用于顱腦損傷、腦血管病后神經(jīng)功能損害的腦復(fù)蘇、腦缺血、急性一氧化碳中毒、潛水減壓病的治療,明顯降低了患者的致死致殘率。由于高壓氧具有抗炎和抗氧化的特性,國外有學者認為高壓氧可以用于SAH后顱內(nèi)血管痙攣的輔助治療,但是目前還不清楚高壓氧治療能否減少蛛網(wǎng)膜下腔出血后炎性因子的釋放進而減輕早期腦損傷,缺乏相關(guān)的生理學及分子生物學研究證據(jù)。近期有一系列的研究表明在脊髓損傷和多臟器衰竭動物模型上,高壓氧能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來減輕炎癥反應(yīng)并減少組織損傷,因此通過高壓氧的這種抗炎機制來減輕SAH后早期腦損傷,可能是一個新的治療思路和方向。本課題擬通過視交叉前池一次注血的方法建造大鼠SAH后EBI模型,并使用高壓氧治療進行干預(yù),來評估TLR4/NF-κB信號通路及下游炎性細胞因子的改變,分析高壓氧治療對于蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷的影響,以期為蛛網(wǎng)膜下腔出血的臨床治療提供新策略。第一部分高壓氧對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷的神經(jīng)保護作用目的：通過視交叉前池一次注血的方法來建立能夠模擬SAH后EBI的動物模型,并探討高壓氧治療對大鼠SAH后EBI是否具有神經(jīng)保護作用。方法：150只健康成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠隨機分為5組,即標準對照組(the sham group,SH,n=30),高壓氧對照組(the sham+2.8 atmospheres absolute HBO group, SH+2.8ATA, n=30),蛛網(wǎng)膜下腔出血組(the SAH group, SAH, n=30),2.0個標準氣壓治療組(the SAH+2.0 atmospheres absolute HBO group, SAH+2.0ATA, n=30)和2.8個標準氣壓治療組(the SAH+2.8 atmospheres absolute HBO group, SAH+2.8 AT A, n=30)。應(yīng)用視交叉前池一次注血法制成SAH后EBI模型,在術(shù)后12h將大鼠放入高壓氧艙內(nèi)進行高壓氧治療,加壓時間為15min,當艙內(nèi)壓力達到2.0或2.8個絕對大氣壓(atmosphere absolute, ATA)后開始穩(wěn)壓,穩(wěn)壓吸氧90min后,均勻變速減壓15min后出艙,總治療時間為120min,每12小時做一次,即術(shù)后第一天接受1次高壓氧治療,第二天和第三天分別接受2次治療,在建模后48h,每組選5只大鼠通過干濕重法分析腦水腫變化,每組選5只大鼠行血腦屏障通透性測定,在建模后24h、48h、72h,每組各取5只大鼠按照不同的時間點分為三個亞組行神經(jīng)功能評分。結(jié)果：在術(shù)后24h時SAH+2.0ATA組和SAH+2.8ATA組的死亡率較SAH組明顯增高(P0.05),而且較SAH+2.0ATA組,SAH+2.8ATA組在24h時死亡率較高,但二者無顯著統(tǒng)計學差異。SAH組SD大鼠神經(jīng)功能評分在各個時間點均較標準對照組明顯降低(P0.01),72h時SAH組大鼠的神經(jīng)功能有一定恢復(fù),但仍未恢復(fù)正常。SH組和SH+2.8ATA組SD大鼠神經(jīng)功能評分對比無統(tǒng)計學差異(P0.05),在三個不同的時間點2.0ATA治療組和2.8ATA治療組SD大鼠神經(jīng)功能評分比較也無顯著差異(P0.05), SAH+2.0ATA及SAH+2.8ATA組在術(shù)后48h及72h神經(jīng)功能評分均較SAH組有明顯改善(P0.05),但在24h時間點的組間差異不顯著(P0.05)。大鼠SAH后48h大腦組織含水量較SH組明顯升高(P0.01),而小腦和腦干含水量變化不明顯(P0.05), SAH+2.0ATA及SAH+2.8ATA組大鼠的大腦半球含水量在48h時相點均較SAH組減輕(P0.05),而兩個不同劑量高壓氧治療組組間則沒有統(tǒng)計學差異(P0.05),在減輕大腦組織水腫方面,2.8ATA壓力的療效并不優(yōu)于2.OATA。相比較對照組,大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后48小時雙側(cè)顳葉底部均出現(xiàn)明顯的伊文氏藍(Evans Blue, EB)滲出增加(P0.01),提示血腦屏障通透性破壞,SH組和SH+2.8ATA組兩組間血腦屏障通透性無明顯差異(P0.05),而SAH+2.0ATA及SAH+2.8ATA組EB滲出均較SAH組明顯減輕(P0.05),且對比2.0ATA治療組,在2.8ATA壓力下大鼠顳葉EB的滲出更少,兩者相比有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論：1.本研究證實通過視交叉前池一次注血法建立大鼠SAH后EBI模型,在術(shù)后24h、48h及72h時大鼠神經(jīng)功能評分均明顯降低,并觀察到SAH后48h時端腦組織含水量增加及血腦屏障破壞,說明此模型可作為研究SAH引發(fā)EBI所需要的動物模型。2.使用高壓氧對SAH大鼠進行治療時,雖然在術(shù)后24h以內(nèi)可能會使大鼠死亡率增加,但在48h及72h時間點明顯促進了SAH大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù),并且在48h時降低了端腦組織含水量和血腦屏障滲透性,并且在減輕血腦屏障破壞方面,2.8ATA壓力高壓氧治療效果可能優(yōu)于2.0ATA。第二部分高壓氧對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠TLR4/NF-κB信號通路表達的影響目的：研究大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織中TLR4/NF-κB信號通路及下游細胞活素和炎性因子的變化,探討高壓氧對TLR4/NF-κB炎性信號通路表達的影響以及對SAH后EBI可能的神經(jīng)保護機制。方法：實驗動物分組、建模及高壓氧處理同前一部分,在建模后每組各有15只大鼠按照造模后的時間分為24h、48h、72h三個亞組,取新鮮顳底皮層腦組織行生物化學分析,了解TLR4/NF-κB信號通路及其下游炎癥因子的表達情況,即采用Western blot和實時定量PCR了解TLR4、NF-κB及ICAM-1的蛋白轉(zhuǎn)錄和合成情況、ELISA檢測信號通路下游炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量,每組再各取5只大鼠采用免疫組化方法檢測TLR4、NF-κB陽性細胞。結(jié)果：在24h、48h、72h時間點,SH組和SH+2.8ATA組之間大鼠腦皮層中TLR4、NF-κB蛋白含量無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05),SAH組大鼠TLR4、NF-κB蛋白在24h表達便開始增高,48h達到高峰,在72h仍維持在較高水平,SAH組24h、48 h、72 h腦皮層中TLR4、NF-κB蛋白表達均顯著高于SH組(P0.01),相較于SAH組,SAH+2.0ATA組與SAH+2.8ATA組在24h、48h、72h三個不同時間點,TLR4、NF-κB蛋白表達均出現(xiàn)明顯下降(P0.05),但兩個不同壓力治療組之間卻沒有顯著差異(P0.05)。蛛網(wǎng)膜下腔出血后48h SAH組大鼠皮層腦組織中ICAM-1蛋白含量比SH組明顯升高(P0.01),而SAH+2.0ATA與SAH+2.8ATA組中ICAM-1蛋白含量均較SAH組顯著降低(P0.05),但ICAM-1蛋白表達在上述兩組中沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。SH組和SH+2.8ATA組大鼠在蛛網(wǎng)膜下腔出血后48h腦皮層中TLR-4與NF-κB mRNA的表達水平無明顯差異(P0.05),而SAH組大鼠TLR-4與NF-κB的mRNA表達水平均顯著高于SH組(P0.01),雖然在SAH+2.0ATA與 SAH+2.8ATA組之間,上述mRNA表達水平均無明顯差異(P0.05),但是兩個高壓氧治療組中TLR4, NF-κB的mRNA表達水平明顯低于SAH組(P0.05)。蛛網(wǎng)膜下腔出血后48h,腦皮層中炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α濃度大幅上升,顯著高于SH組(P0.01),在兩種不同壓力的高壓氧治療組中,上述炎癥因子濃度均有一定程度的降低(P0.05),但是在SAH+2.0ATA與SAH+2.8ATA組之間,這三種細胞因子的含量沒有顯著差異(P0.05)。在SH組及SH+2.8ATA組中,TLR4和NF-κB陽性細胞比率很低,且兩者相比無顯著性差異(P0.05)。而相較于SH組,SAH組中TLR4、NF-κB陽性細胞的比率明顯上升(P0.01,),且兩種不同壓力高壓氧治療組陽性細胞比率均較SAH組明顯下降(P0.05),但SAH+2.0ATA與SAH+2.8ATA組之間,TLR4、NF-κB陽性細胞比率均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論：1.蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期存在著TLR4/NF-κB信號傳導通路的激活,其下游炎性因子的表達也明顯增加,這可能是引起蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的重要機制。2.高壓氧治療在蛋白轉(zhuǎn)錄及合成兩個方面降低了蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦皮層組織中TLR、NF-κB的含量,并抑制了該信號通路下游IL-1β, TNF-α, IL-6及ICAM-1等細胞因子的表達,減輕了炎性反應(yīng)和腦損傷,這可能是高壓氧對蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷神經(jīng)保護作用的潛在機制之一。3.在抑制TLR4/NF-κB信號通路激活及其下游炎性因子表達方面,對于蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠2.8ATA壓力高壓氧治療效果并不優(yōu)于2.0ATA。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743.35

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