【摘要】：背景和目的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤,世界衛(wèi)生組織在2007年針對(duì)膠質(zhì)瘤依據(jù)惡性程度等生物學(xué)特性進(jìn)行了分級(jí),其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是第Ⅳ級(jí),占所有惡性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的25%。在歐洲和北美平均每10萬(wàn)人有2-3人患病,但是約50%的患者積極治療情況下仍在1年內(nèi)死亡。基于某些遺傳和臨床特征分為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤沒有任何低度腫瘤病變史,多見于50歲以上的成年人,大多數(shù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是原發(fā)性腫瘤;而繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤一般從較低級(jí)別膠質(zhì)細(xì)胞瘤逐漸發(fā)展而來(lái),通常需要5-10年的時(shí)間,多見于小于45歲的成年人,發(fā)病年齡較原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相對(duì)較輕;近幾年隨著研究的更加深入,人們根據(jù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因表型的不同,將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分為4種類型,即我們常說(shuō)的Classical、Mesenchymal、Proneural和Neural四種亞型,科學(xué)家進(jìn)行該種分類的初衷在于:通過基因型的不同分類希望尋找治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的有效的可靠的方法。Micro RNAs(miRNAs)即微小RNA,是非編碼RNA家族的重要成員;結(jié)構(gòu)上由大約22個(gè)核苷酸組成的,進(jìn)化時(shí)高度一致的單鏈RNA。miRNAs主要通過引起目標(biāo)m RNA的翻譯抑制或降解,進(jìn)而調(diào)控目標(biāo)m RNA的表達(dá)。miRNAs的異常表達(dá)在人類腫瘤形成過程起著不可替代作用。近年來(lái),許多研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞形成過程中,miRNAs與細(xì)胞的增殖,侵襲及遷移等相關(guān)行為密切相關(guān)。目前miR-506(miR-506)在其他腫瘤中的研究的相關(guān)報(bào)道已經(jīng)很多,比如胃癌、肝瘤、乳腺癌、骨肉癌及膀胱癌等,但是目前研究認(rèn)為:在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,miR-506既可能發(fā)揮癌基因的作用也可能發(fā)揮抑癌基因的作用,但目前miR-506在膠質(zhì)瘤中的作用特性尚未可知,為探究miR-506在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的生物學(xué)特性,我們選擇引入miR-506模擬物來(lái)促進(jìn)其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá);隨后我們利用生物信息學(xué)及分子生物學(xué)的方法,對(duì)其靶基因進(jìn)行了初步鑒定。本課題并進(jìn)一步分析了miR-506以及靶基因IGF2BP1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化和增殖的調(diào)節(jié)特性。第一部分miR-506在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)臨床意義及生物學(xué)功能目的:研究miR-506在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)及和臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。探討miR-506在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)作用特性及其分子機(jī)制。方法:1.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)miR-506在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(U87,U251,LN229和A172)中的表達(dá)和在正常腦組織中的表達(dá)情況。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-506 mimics后利用MTT法檢測(cè)miR-506過表達(dá)后對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-506模擬物對(duì)細(xì)胞周期的影響。3.采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)膠侵襲transwell實(shí)驗(yàn),分別檢測(cè)miR-506過表達(dá)后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲能力,進(jìn)一步分析了影響侵襲的分子機(jī)制。4.采用克隆形成實(shí)驗(yàn)分析miR-506對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力的影響。結(jié)果:1.miR-506在4個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株細(xì)胞系(U87,U251,LN229和A172)中的表達(dá)較在正常腦組織中的表達(dá)顯著減低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.CCK8實(shí)驗(yàn)顯示miR-506誘導(dǎo)的U87細(xì)胞系較scramble組增殖能力顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)也顯示U87細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-506mimic后,細(xì)胞周期在G0/G1期有明顯的停滯。3.應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-506對(duì)細(xì)胞侵襲性方面的影響,采用miR-506 mimic轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞系的侵襲能力較scramble組明顯降低;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-506 mimic轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞系的遷移能力較scramble組明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-506 mimic后MMP1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),MMP11蛋白水平無(wú)明顯變化。結(jié)論:miR-506的表達(dá)情況與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床進(jìn)展密切相關(guān),miR-506過表達(dá)能顯著的抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖與侵襲。miR-506對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲影響的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)MMP1、MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,本研究的結(jié)果顯示miR-506在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展過程中可能起到抑癌基因的作用。第二部分miR-506調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖浸潤(rùn)的機(jī)制研究目的:利用生物信息技術(shù)對(duì)miR-506的靶基因進(jìn)行篩選和鑒定,研究miR-506及其靶基因參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤疾病進(jìn)展的分子機(jī)制。方法:1.利用micro RNA在線數(shù)據(jù)庫(kù)(miRanda、Targert Scan、Pictar)預(yù)測(cè)miR-506的靶基因。2.利用熒光素酶和westernblot技術(shù)檢測(cè)miR-506是否可以靶向調(diào)控IGF2BP1基因。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染IGF2BP1過表達(dá)質(zhì)粒后利用MTT法檢測(cè)IGF2BP1過表達(dá)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IGF2BP1過表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響。4.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法及組織芯片技術(shù)檢測(cè)IGF2BP1蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)情況,以及IGF2BP1蛋白表達(dá)強(qiáng)度與患者臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果:1.應(yīng)用Target Scan軟件,我們發(fā)現(xiàn)IGF2BP1的3’UTR有固定的結(jié)合位點(diǎn),在U87細(xì)胞系中過度表達(dá)的miR-506抑制p GL3-WT-IGF2BP1-3’UTR質(zhì)粒的活性,在免疫熒光素酶活性分析中p GL3-MUT-IGF2BP1-3’UTR質(zhì)�；钚詿o(wú)改變,而且,在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中miR-506抑制IGF2BP1的m RNA和蛋白水平的表達(dá)。2.IGF2BP1沉默后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖能力顯著下降,G0/G1周期的細(xì)胞周期停滯增加。3.IGF2BP1過表達(dá)后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖能力顯著增加,G0/G1周期的細(xì)胞周期停滯減少。4.IGF2BP1表達(dá)水平與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床病理參數(shù)的分析結(jié)果表明:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后與IGF2BP1表達(dá)水平(P=0.001)明顯相關(guān);Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示IGF2BP1低表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的生存時(shí)間明顯高于IGF2BP1高表達(dá)的患者,提示IGF2BP1的表達(dá)水平和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。結(jié)論:1.miR-506在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中能靶向調(diào)控IGF2BP1的表達(dá);沉默IGF2BP1表達(dá)后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力顯著下降,細(xì)胞周期明顯停滯;過表達(dá)IGF2BP1后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力得到部分恢復(fù),細(xì)胞周期停滯明顯減少。2.IGF2BP1高表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯短于IGF2BP1低表達(dá)的患者。3.miR-506通過負(fù)性調(diào)節(jié)其靶基因IGF2BP1的蛋白表達(dá),從而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展,可能成為臨床膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的新靶點(diǎn)。全文結(jié)論1.miR-506在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)較在正常組織和細(xì)胞中的表達(dá)均明顯降低。2.體內(nèi)外研究結(jié)果顯示:miR-506過表達(dá)后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移和侵襲能力以及成瘤能力明顯下降,且細(xì)胞周期停滯,提示miR-506在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到抑癌基因作用。3.miR-506在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中能夠靶向調(diào)控IGF2BP1的表達(dá);沉默IGF2BP1表達(dá)后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖能力顯著下降,細(xì)胞周期明顯停滯;過表達(dá)IGF2BP1后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖能力得到部分恢復(fù),細(xì)胞周期停滯的細(xì)胞明顯減少。4.IGF2BP1高表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯短于IGF2BP1低表達(dá)的患者。5.miR-506通過負(fù)性調(diào)節(jié)其靶基因IGF2BP1的蛋白表達(dá),從而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展,miR-506/IGF2BP1調(diào)節(jié)軸在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用,有可能成為臨床上膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的新靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.4

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本文編號(hào)：2339360