【摘要】：第一部分頸動(dòng)脈分叉部動(dòng)脈瘤模型的建立目的:探討血流動(dòng)力增加聯(lián)合彈力蛋白酶消化血管壁內(nèi)彈力板和中膜結(jié)構(gòu),建立犬動(dòng)脈分叉頂端實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈瘤的可行性。方法:(1)通過在體試驗(yàn)測試不同濃度彈力蛋白酶、在不同孵化時(shí)間下對(duì)血管壁結(jié)構(gòu)破壞程度,選擇構(gòu)建頸動(dòng)脈彈力板和中膜破壞最佳彈力蛋白酶濃度和孵化時(shí)間;(2)實(shí)驗(yàn)犬18只,手術(shù)重建犬頸總動(dòng)脈構(gòu)建Y-型動(dòng)脈分叉,9只Y-型分叉分叉頂端采用彈力蛋白酶孵化,9只Y-型分叉頂端給予生理鹽水假處理。術(shù)后1周、4周、3月行TCD和多普勒以及頸動(dòng)脈血管造影觀察Y-型分叉頂端是否伴有動(dòng)脈瘤形成或動(dòng)脈瘤樣結(jié)構(gòu)早期變化。術(shù)后3月獲取Y-型分叉頂端組織學(xué)標(biāo)本行病理學(xué)檢查。結(jié)果:(1)濃度為3.0 U/μl的彈力蛋白酶溶液持續(xù)孵化頸總動(dòng)脈血管壁能夠有效破壞內(nèi)彈力板和中膜。(2)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Y-型分叉近端供養(yǎng)動(dòng)脈血流速度術(shù)前、術(shù)后無明顯差異,術(shù)后1周、3月所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Y-型分叉近端供養(yǎng)動(dòng)脈血流速度均較術(shù)前明顯增加。9只經(jīng)彈力蛋白酶處理的Y-型分叉頂端實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈,隨訪血管造影和組織學(xué)觀察5只可見頂端囊狀動(dòng)脈瘤形成,形態(tài)為寬基底型,瘤體平均直徑3.2±0.4 mm,瘤頸6.7±2.3 mm;未經(jīng)彈力蛋白酶處理的Y-型分叉頂端實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈,隨訪血管造影均未見囊狀動(dòng)脈瘤形成。組織學(xué)觀察顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分叉頂端均可見新生內(nèi)膜墊形成,實(shí)驗(yàn)組鄰近新生內(nèi)膜墊附近可見典型動(dòng)脈瘤病理結(jié)構(gòu),而對(duì)照組鄰近新生內(nèi)膜墊附近可見動(dòng)脈瘤樣血管壁重塑。結(jié)論:血流動(dòng)力增加聯(lián)合彈力蛋白酶消化血管壁內(nèi)彈力板和中膜結(jié)構(gòu)能誘導(dǎo)犬動(dòng)脈分叉頂端實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈瘤。該犬模型可以用來進(jìn)一步研究血流動(dòng)力學(xué)、基因、蛋白或生理通道等對(duì)動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展、破裂的作用。第二部分頸動(dòng)脈分叉部動(dòng)脈瘤模型的組織病理學(xué)研究目的:在犬分叉部血管動(dòng)物模型建立的基礎(chǔ)上,研究動(dòng)脈壁退化、炎癥和細(xì)胞免疫反應(yīng)是否會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。方法:建立18只犬頸總動(dòng)脈(CCA)新的動(dòng)脈分叉模型,隨機(jī)分組為彈力蛋白酶處理動(dòng)脈組(EBG,n=9)和分叉模型對(duì)照組(CBG,n=9)。同時(shí)用彈力蛋白酶處理直段CCA作為直段對(duì)照組(ESG,n=3)。分別在術(shù)后12周(n=6)和24周(n=3)取EBG和CBG重建血管分叉的樣本,ESG(n=3)在術(shù)后24周取雙側(cè)頸動(dòng)脈直血管樣本。術(shù)后獲得的CCA樣本行HE染色、Masson染色和彈力纖維染色。連續(xù)切片來評(píng)估重建血管分叉部組織學(xué)改變用Envision技術(shù)以抗小鼠增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體、小鼠α單克隆平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體、小鼠抗巨噬細(xì)胞單克隆抗體(MAC387)、MMP-2和MMP-9單克隆抗體為CCA樣本行免疫標(biāo)記。采用抗CD45的白細(xì)胞抗體和抗MAC387的抗巨噬細(xì)胞抗體行免疫雙熒光染色,判斷白細(xì)胞中是包含否有巨噬細(xì)胞。測量平滑肌細(xì)胞增殖率(PCNA陽性平滑肌細(xì)胞所占比例)、彈力層和肌動(dòng)蛋白陽性平滑肌層厚。炎癥細(xì)胞浸潤指數(shù)為CD45陽性細(xì)胞在血管分叉中膜有核細(xì)胞所占百分比。MMP-2和MMP-9表達(dá)水平定義為MMP-2/9陽性區(qū)域在血管分叉中膜中所占的面積百分比。組織病理學(xué)圖像的統(tǒng)計(jì)分析軟件為Image-Pro Plus Version 6.0版(Media Cybernetics,Inc.,Bethesda,MD,USA),每個(gè)切片的中至少隨機(jī)選擇20個(gè)以上的高倍鏡視野(×400倍)進(jìn)行分析。用軟件Graph Pad Prism 5.0(San Diego,CA,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)變量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)值變量以數(shù)量或百分比表示。用確切概率法(Fisher’s檢驗(yàn))來比較分類資料。組間t檢驗(yàn)來比較平滑肌細(xì)胞增殖率、彈力層和肌動(dòng)蛋白陽性平滑肌層厚、炎癥細(xì)胞浸潤程度、MMP-2和MMP-9表達(dá)水平。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)雙側(cè)檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:在形成動(dòng)脈瘤的5個(gè)血管分叉樣本中,活體組織觀察發(fā)現(xiàn)整個(gè)血管壁變薄,成為半透明狀態(tài),并能觀察到內(nèi)部血流,從而容易導(dǎo)致變薄的血管壁膨出,分叉部動(dòng)脈瘤形成。HE染色、Masson染色顯示ESG和EBG分叉部中膜變薄,平滑肌細(xì)胞減少,纖維連接缺失。彈力纖維染色顯示ESG和EBG中,內(nèi)彈力板不連續(xù),彈力纖維斷裂;CBG中三只動(dòng)物動(dòng)脈分叉頂部出現(xiàn)內(nèi)膜輕度損傷。彈力蛋白酶的作用降低了中膜彈力纖維層厚,在EBG為21.2±15.3μm,ESG為71.28±19.47μm,而CBG中為119.4±29.9μm(P0.001)。免疫組化染色顯示,EBS中彈力蛋白酶處理過的動(dòng)脈分叉頂部血管壁SMA陽性的平滑肌細(xì)胞數(shù)量減少,PCNA陽性的平滑肌細(xì)胞數(shù)目比例明顯增加,EBG中為42.0±15.7%(對(duì)比ESG中為7.3±3.8%,CBG中為8.0±6.3%;P0.001),平滑肌層變薄,在EBG中為31.3±16.7μm(對(duì)比ESG中136.5±25.5μm,CBG中133.9±26.1μm,P0.001)。血管壁炎癥細(xì)胞浸潤程度EBG中為38.4±10.6%(對(duì)比ESG中5.1±2.1%,CBG中2.9±2.4%;P0.001)。巨噬細(xì)胞染色顯示血管壁內(nèi)有巨噬細(xì)胞浸潤,分布和白細(xì)胞相似。動(dòng)脈瘤壁MMP-2和MMP-9表達(dá)水平分別為21.0±8.7%(對(duì)比ESG中1.2±1.4%,CBG中0.8±1.2%;P0.001)和13.6±5.6%(對(duì)比ESG中0.9±0.8%,CBG中0.4±0.6%;P0.001)。結(jié)論:經(jīng)過24周隨訪,EBG中5/9成功誘發(fā)動(dòng)脈瘤,均經(jīng)血管造影及病理確認(rèn)。組織學(xué)分析顯示EBG內(nèi)彈力板(IEL)不連續(xù)、彈力纖維斷裂、肌層變薄、平滑肌細(xì)胞減少、炎性細(xì)胞浸潤(巨噬細(xì)胞)以及MMP-2和MMP-9表達(dá)增多(對(duì)比CBG和ESG,P0.001)。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展和血管壁結(jié)構(gòu)退行性變相關(guān),炎癥免疫反應(yīng)在動(dòng)脈瘤形成、生長中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。第三部分頸動(dòng)脈分叉部動(dòng)脈瘤模型的形態(tài)學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)研究目的:在犬分叉部血管動(dòng)物模型建立的基礎(chǔ)上,研究特定血流動(dòng)力學(xué)變化、形態(tài)學(xué)變化是否會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。方法:建立18只犬頸總動(dòng)脈(CCA)新的動(dòng)脈分叉模型,隨機(jī)分組為彈力蛋白酶處理動(dòng)脈組(EBG,n=9)和分叉模型對(duì)照組(CBG,n=9)。同時(shí)用彈力蛋白酶處理直段CCA作為直段對(duì)照組(ESG,n=3)。在術(shù)后即刻、術(shù)后12周、術(shù)后24周分別行血管造影和計(jì)算機(jī)流體動(dòng)力學(xué)(CFD)分析,如果動(dòng)脈瘤樣囊泡形成,從3D-DSA圖像上分別測量瘤頸和瘤體最大值、載瘤動(dòng)脈直徑和角度。用3D-DSA行旋轉(zhuǎn)性血管造影(Syngo AXIOM-Artis,Siemens,Germany)對(duì)重建血管分叉部進(jìn)行三維成像,并測血管分叉血流流速作為邊界條件引入CFD模擬軟件(Mimics 10.0;Materialise,Leuven,Belgium),分析壁切應(yīng)力(橫向力WSS),流速場,流速曲線,表面相對(duì)壓力場(縱向力)和總壓力場。計(jì)算壁切應(yīng)力梯度(WSSG),同時(shí)對(duì)EBG血管分叉模型的WSS和WSSG進(jìn)行定量分析。結(jié)果:血管分叉模型在所有動(dòng)物均成功建立。血管造影顯示EBG組9只犬模型中的5只可以在動(dòng)脈分叉頂部觀察到新生動(dòng)脈瘤形成。但EBG隨訪24周后未觀察到動(dòng)脈瘤破裂,較12周隨訪時(shí)僅有輕度增大(3.5±0.3 mm對(duì)比3.0±0.2 mm;P=0.076)。載瘤動(dòng)脈直徑和成角分別為在CBG為4.3±0.4 mm和112.9±36.1°,在EBG為4.3±0.4 mm和120.3±44.2°。EBG中形成動(dòng)脈瘤模型的5根載瘤動(dòng)脈分叉角度為146.8±40.84°,而對(duì)照組為87.25±18.87°(P=0.032)。CFD分析顯示:由于對(duì)側(cè)CCA的結(jié)扎,重建血管分叉中載瘤動(dòng)脈內(nèi)血流速度從85.3±7.5 cm/s增長至128.8±13.1 cm/s。術(shù)后CBG和EBG載瘤動(dòng)脈壁WSS增高,血管分叉根部區(qū)域處于一個(gè)更為復(fù)雜的血流動(dòng)力學(xué)環(huán)境中。血管分叉頂部WSS減低、血流速度減慢,沿分叉頂部往兩側(cè),WSS和血流速度都是先增大至最大值而后下降至和直段動(dòng)脈相近。分叉頂部的相對(duì)壓力和總壓力最高,然后再向血管分支方向減低至正常值。血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)在術(shù)后和24周后在ESG、CBG和EBG中4/9沒有出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變的模型中是相似的。EBG中5/9產(chǎn)生動(dòng)脈瘤的血管的WSS和WSSG進(jìn)行定量分析,分別在動(dòng)脈分叉頂部同側(cè)相距1、2、3mm處進(jìn)行,顯示術(shù)后24周發(fā)生明顯下降(P≤0.01),這導(dǎo)致囊狀動(dòng)脈瘤的形成。這些動(dòng)物隨訪過程中相對(duì)壓力和總壓力也是降低的。對(duì)EBG術(shù)后WSS和WSSG的定量分析顯示動(dòng)脈瘤形成的模型較無動(dòng)脈瘤形成的模型WSS(多在頂部2mm處)和WSSG(頂部0-2mm處)通常更高。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)雖然對(duì)所有模型都進(jìn)行了彈力纖維的損傷來模擬動(dòng)脈壁退化,但只有在5/9模型中出現(xiàn)了新生動(dòng)脈瘤。我們認(rèn)為血管分叉角度是重要的影響因素,“T”型分叉(146.8±40.84°)比“Y”型分叉(87.25±18.87°)更易發(fā)生動(dòng)脈瘤。分叉角度與血流速度和渦流強(qiáng)度緊密相關(guān),角度越大,分叉頂部周圍渦流強(qiáng)度越大,層流紊亂,從而產(chǎn)生各種機(jī)械刺激,如WSS和WSSG。本實(shí)驗(yàn)對(duì)血管分叉部WSS和WSSG的定量分析證明較大血管分叉模型動(dòng)脈瘤形成前,動(dòng)脈分叉頂部周圍WSS和WSSG較高。WSS或WSSG的增高損傷了正常血管內(nèi)皮的功能,激發(fā)基因轉(zhuǎn)錄,激活離子通道,從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重組。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 齊巍,趙繼宗,王碩,王嶸;免疫炎性反應(yīng)與顱內(nèi)囊性動(dòng)脈瘤基質(zhì)重塑的組織病理學(xué)研究[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2004年04期

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本文編號(hào)：2338397