發(fā)布時間：2018-11-17 16:12

【摘要】：第一部分頸動脈分叉部動脈瘤模型的建立目的:探討血流動力增加聯(lián)合彈力蛋白酶消化血管壁內彈力板和中膜結構,建立犬動脈分叉頂端實驗性動脈瘤的可行性。方法:(1)通過在體試驗測試不同濃度彈力蛋白酶、在不同孵化時間下對血管壁結構破壞程度,選擇構建頸動脈彈力板和中膜破壞最佳彈力蛋白酶濃度和孵化時間;(2)實驗犬18只,手術重建犬頸總動脈構建Y-型動脈分叉,9只Y-型分叉分叉頂端采用彈力蛋白酶孵化,9只Y-型分叉頂端給予生理鹽水假處理。術后1周、4周、3月行TCD和多普勒以及頸動脈血管造影觀察Y-型分叉頂端是否伴有動脈瘤形成或動脈瘤樣結構早期變化。術后3月獲取Y-型分叉頂端組織學標本行病理學檢查。結果:(1)濃度為3.0 U/μl的彈力蛋白酶溶液持續(xù)孵化頸總動脈血管壁能夠有效破壞內彈力板和中膜。(2)實驗組和對照組Y-型分叉近端供養(yǎng)動脈血流速度術前、術后無明顯差異,術后1周、3月所有實驗動物Y-型分叉近端供養(yǎng)動脈血流速度均較術前明顯增加。9只經(jīng)彈力蛋白酶處理的Y-型分叉頂端實驗動脈,隨訪血管造影和組織學觀察5只可見頂端囊狀動脈瘤形成,形態(tài)為寬基底型,瘤體平均直徑3.2±0.4 mm,瘤頸6.7±2.3 mm;未經(jīng)彈力蛋白酶處理的Y-型分叉頂端實驗動脈,隨訪血管造影均未見囊狀動脈瘤形成。組織學觀察顯示實驗組和對照組分叉頂端均可見新生內膜墊形成,實驗組鄰近新生內膜墊附近可見典型動脈瘤病理結構,而對照組鄰近新生內膜墊附近可見動脈瘤樣血管壁重塑。結論:血流動力增加聯(lián)合彈力蛋白酶消化血管壁內彈力板和中膜結構能誘導犬動脈分叉頂端實驗性動脈瘤。該犬模型可以用來進一步研究血流動力學、基因、蛋白或生理通道等對動脈瘤發(fā)生、發(fā)展、破裂的作用。第二部分頸動脈分叉部動脈瘤模型的組織病理學研究目的:在犬分叉部血管動物模型建立的基礎上,研究動脈壁退化、炎癥和細胞免疫反應是否會導致動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。方法:建立18只犬頸總動脈(CCA)新的動脈分叉模型,隨機分組為彈力蛋白酶處理動脈組(EBG,n=9)和分叉模型對照組(CBG,n=9)。同時用彈力蛋白酶處理直段CCA作為直段對照組(ESG,n=3)。分別在術后12周(n=6)和24周(n=3)取EBG和CBG重建血管分叉的樣本,ESG(n=3)在術后24周取雙側頸動脈直血管樣本。術后獲得的CCA樣本行HE染色、Masson染色和彈力纖維染色。連續(xù)切片來評估重建血管分叉部組織學改變用Envision技術以抗小鼠增殖細胞核抗原(PCNA)抗體、小鼠α單克隆平滑肌肌動蛋白抗體、小鼠抗巨噬細胞單克隆抗體(MAC387)、MMP-2和MMP-9單克隆抗體為CCA樣本行免疫標記。采用抗CD45的白細胞抗體和抗MAC387的抗巨噬細胞抗體行免疫雙熒光染色,判斷白細胞中是包含否有巨噬細胞。測量平滑肌細胞增殖率(PCNA陽性平滑肌細胞所占比例)、彈力層和肌動蛋白陽性平滑肌層厚。炎癥細胞浸潤指數(shù)為CD45陽性細胞在血管分叉中膜有核細胞所占百分比。MMP-2和MMP-9表達水平定義為MMP-2/9陽性區(qū)域在血管分叉中膜中所占的面積百分比。組織病理學圖像的統(tǒng)計分析軟件為Image-Pro Plus Version 6.0版(Media Cybernetics,Inc.,Bethesda,MD,USA),每個切片的中至少隨機選擇20個以上的高倍鏡視野(×400倍)進行分析。用軟件Graph Pad Prism 5.0(San Diego,CA,USA)進行統(tǒng)計分析。連續(xù)變量用平均值±標準差表示,數(shù)值變量以數(shù)量或百分比表示。用確切概率法(Fisher’s檢驗)來比較分類資料。組間t檢驗來比較平滑肌細胞增殖率、彈力層和肌動蛋白陽性平滑肌層厚、炎癥細胞浸潤程度、MMP-2和MMP-9表達水平。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)雙側檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果:在形成動脈瘤的5個血管分叉樣本中,活體組織觀察發(fā)現(xiàn)整個血管壁變薄,成為半透明狀態(tài),并能觀察到內部血流,從而容易導致變薄的血管壁膨出,分叉部動脈瘤形成。HE染色、Masson染色顯示ESG和EBG分叉部中膜變薄,平滑肌細胞減少,纖維連接缺失。彈力纖維染色顯示ESG和EBG中,內彈力板不連續(xù),彈力纖維斷裂;CBG中三只動物動脈分叉頂部出現(xiàn)內膜輕度損傷。彈力蛋白酶的作用降低了中膜彈力纖維層厚,在EBG為21.2±15.3μm,ESG為71.28±19.47μm,而CBG中為119.4±29.9μm(P0.001)。免疫組化染色顯示,EBS中彈力蛋白酶處理過的動脈分叉頂部血管壁SMA陽性的平滑肌細胞數(shù)量減少,PCNA陽性的平滑肌細胞數(shù)目比例明顯增加,EBG中為42.0±15.7%(對比ESG中為7.3±3.8%,CBG中為8.0±6.3%;P0.001),平滑肌層變薄,在EBG中為31.3±16.7μm(對比ESG中136.5±25.5μm,CBG中133.9±26.1μm,P0.001)。血管壁炎癥細胞浸潤程度EBG中為38.4±10.6%(對比ESG中5.1±2.1%,CBG中2.9±2.4%;P0.001)。巨噬細胞染色顯示血管壁內有巨噬細胞浸潤,分布和白細胞相似。動脈瘤壁MMP-2和MMP-9表達水平分別為21.0±8.7%(對比ESG中1.2±1.4%,CBG中0.8±1.2%;P0.001)和13.6±5.6%(對比ESG中0.9±0.8%,CBG中0.4±0.6%;P0.001)。結論:經(jīng)過24周隨訪,EBG中5/9成功誘發(fā)動脈瘤,均經(jīng)血管造影及病理確認。組織學分析顯示EBG內彈力板(IEL)不連續(xù)、彈力纖維斷裂、肌層變薄、平滑肌細胞減少、炎性細胞浸潤(巨噬細胞)以及MMP-2和MMP-9表達增多(對比CBG和ESG,P0.001)。根據(jù)我們的實驗數(shù)據(jù)推測動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展和血管壁結構退行性變相關,炎癥免疫反應在動脈瘤形成、生長中發(fā)揮了至關重要的作用。第三部分頸動脈分叉部動脈瘤模型的形態(tài)學、血流動力學研究目的:在犬分叉部血管動物模型建立的基礎上,研究特定血流動力學變化、形態(tài)學變化是否會導致動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。方法:建立18只犬頸總動脈(CCA)新的動脈分叉模型,隨機分組為彈力蛋白酶處理動脈組(EBG,n=9)和分叉模型對照組(CBG,n=9)。同時用彈力蛋白酶處理直段CCA作為直段對照組(ESG,n=3)。在術后即刻、術后12周、術后24周分別行血管造影和計算機流體動力學(CFD)分析,如果動脈瘤樣囊泡形成,從3D-DSA圖像上分別測量瘤頸和瘤體最大值、載瘤動脈直徑和角度。用3D-DSA行旋轉性血管造影(Syngo AXIOM-Artis,Siemens,Germany)對重建血管分叉部進行三維成像,并測血管分叉血流流速作為邊界條件引入CFD模擬軟件(Mimics 10.0;Materialise,Leuven,Belgium),分析壁切應力(橫向力WSS),流速場,流速曲線,表面相對壓力場(縱向力)和總壓力場。計算壁切應力梯度(WSSG),同時對EBG血管分叉模型的WSS和WSSG進行定量分析。結果:血管分叉模型在所有動物均成功建立。血管造影顯示EBG組9只犬模型中的5只可以在動脈分叉頂部觀察到新生動脈瘤形成。但EBG隨訪24周后未觀察到動脈瘤破裂,較12周隨訪時僅有輕度增大(3.5±0.3 mm對比3.0±0.2 mm;P=0.076)。載瘤動脈直徑和成角分別為在CBG為4.3±0.4 mm和112.9±36.1°,在EBG為4.3±0.4 mm和120.3±44.2°。EBG中形成動脈瘤模型的5根載瘤動脈分叉角度為146.8±40.84°,而對照組為87.25±18.87°(P=0.032)。CFD分析顯示:由于對側CCA的結扎,重建血管分叉中載瘤動脈內血流速度從85.3±7.5 cm/s增長至128.8±13.1 cm/s。術后CBG和EBG載瘤動脈壁WSS增高,血管分叉根部區(qū)域處于一個更為復雜的血流動力學環(huán)境中。血管分叉頂部WSS減低、血流速度減慢,沿分叉頂部往兩側,WSS和血流速度都是先增大至最大值而后下降至和直段動脈相近。分叉頂部的相對壓力和總壓力最高,然后再向血管分支方向減低至正常值。血流動力學參數(shù)在術后和24周后在ESG、CBG和EBG中4/9沒有出現(xiàn)形態(tài)學改變的模型中是相似的。EBG中5/9產(chǎn)生動脈瘤的血管的WSS和WSSG進行定量分析,分別在動脈分叉頂部同側相距1、2、3mm處進行,顯示術后24周發(fā)生明顯下降(P≤0.01),這導致囊狀動脈瘤的形成。這些動物隨訪過程中相對壓力和總壓力也是降低的。對EBG術后WSS和WSSG的定量分析顯示動脈瘤形成的模型較無動脈瘤形成的模型WSS(多在頂部2mm處)和WSSG(頂部0-2mm處)通常更高。結論:本實驗雖然對所有模型都進行了彈力纖維的損傷來模擬動脈壁退化,但只有在5/9模型中出現(xiàn)了新生動脈瘤。我們認為血管分叉角度是重要的影響因素,“T”型分叉(146.8±40.84°)比“Y”型分叉(87.25±18.87°)更易發(fā)生動脈瘤。分叉角度與血流速度和渦流強度緊密相關,角度越大,分叉頂部周圍渦流強度越大,層流紊亂,從而產(chǎn)生各種機械刺激,如WSS和WSSG。本實驗對血管分叉部WSS和WSSG的定量分析證明較大血管分叉模型動脈瘤形成前,動脈分叉頂部周圍WSS和WSSG較高。WSS或WSSG的增高損傷了正常血管內皮的功能,激發(fā)基因轉錄,激活離子通道,從而導致細胞骨架的重組。
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【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

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1 齊巍,趙繼宗,王碩,王嶸;免疫炎性反應與顱內囊性動脈瘤基質重塑的組織病理學研究[J];首都醫(yī)科大學學報;2004年04期

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本文編號：2338397