發(fā)布時間：2018-11-12 17:40

【摘要】：背景： 惡性外周神經(jīng)鞘瘤(MPNST)被認為是起源于施旺細胞或神經(jīng)嵴細胞的多能細胞的罕見肉瘤。半數(shù)的PNST的發(fā)生和1型神經(jīng)纖維瘤病(NF1)密切相關(guān),NF1是一種良性外周神經(jīng)腫瘤,其發(fā)生率占總?cè)丝诘?.02%。盡管MPNST的發(fā)生率不高,但是MPNST在兒童的發(fā)生比例占所有軟組織肉瘤的4%到10%,并且通常都是致命的。對于MPNST的主要治療手段一般為手術(shù)治療,但是這種治療手段經(jīng)常不能完全切除腫瘤組織。而其它的治療手段包括化療和放療的治療效果還不是很理想。因此,發(fā)展新的治療MPNST是目前臨床上繼續(xù)的。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,分子靶向治療被認為是治療MPNST非常有前景且有效的治療手段。 小分子RNA (microRNA, miRNA)是一簇具有18-25個核苷酸長度的短小的非編碼RNA,主要通過促進mRNA的降解或者翻譯抑制來參與對一系列人類基因的表達抑制。MiRNA已經(jīng)被證明能夠調(diào)節(jié)許多細胞活動,包括細胞增殖、分化、死亡和代謝等。異常表達的miRNA與癌癥發(fā)生和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此對許多惡性腫瘤的診斷和預(yù)后具有極大的潛力。此外,積累的研究表明miRNA還能夠作為一種功能強大的工具用于治療許多惡性腫瘤。 MiRNA-210是目前為止發(fā)現(xiàn)最重要的一種miRNA,它參與了對細胞增殖、DNA修復(fù)、代謝和細胞遷移等細胞活動。越來越多的數(shù)據(jù)表明miRNA-210是一種低氧或缺氧誘導(dǎo)的miRNA,并被缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)所調(diào)控。由于miRNA-210在低氧條件下被HIF所調(diào)控,miRNA-210在許多中癌癥包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎透明細胞癌、肺癌和乳腺癌等組織中表達上調(diào)。而且,miRNA-210被發(fā)現(xiàn)作為癌基因能夠通過調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展。然而,直到目前,miRNA-210在MPNST中的作用和機制還不是很清楚。 因此,研究]miRNA-210對MPNST細胞增殖和侵襲能力的影響以及分析其潛在的分子機制將有助于理解MPNST的病理,并因此發(fā)展?jié)撛谥委烳PNST的手段。 第一部分.MiRNA-210對MPNST增殖和侵襲的影響 目的： (1).檢測miRNA-210在MPNST中的表達。 (2).研究miRNA-210在MPNST的增殖和侵襲中的作用。 方法和結(jié)果： (1).通過Real-time PCR實驗檢測rniRNA-210在SK-N-SH細胞和MPNST細胞系包括ST88-14、sNF96.2、T265p21和YST-1的表達,發(fā)現(xiàn)miRNA-210在ST88-14和sNF96.2細胞中表達極大的上調(diào)。 (2).分別轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210、pre-con、anti-miRNA-210或anti-con進入ST88-14和sNF96.2細胞中。通過MTT和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn),相比于轉(zhuǎn)染對照,轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210的ST88-14和sNF96.2細胞的細胞生存率和克隆形成效率明顯增加。相反,相比于對照,轉(zhuǎn)染anti-miRNA-210的ST88-14和sNF96.2細胞的增殖和克隆形成效率下降了。 (3).流式細胞術(shù)結(jié)果證明轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210進入ST88-14和sNF96.2細胞后能夠顯著的增加S期細胞。相反,轉(zhuǎn)染anti-miRNA-210進入ST88-14和sNF96.2細胞后則顯著的減少了S期細胞。 (4).Transwell小室實驗證明了轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210進入ST88-14和sNF96.2細胞后顯著增加了細胞侵襲能力。然而,通過轉(zhuǎn)染anti-miRNA-210抑制ST88-14和sNF96.2細胞中內(nèi)源的rniRNA-210的表達減少了細胞侵襲能力。 結(jié)論： (1).MiRNA-210在MPNST細胞ST88-14和sNF96.2中表達升高。 (2). MiRNA-210促進了MPNST細胞的增殖和侵襲能力。 第二部分.MiRNA-210在MPNST中靶向抑制了EFNA3基因的表達 目的： (1).識別miRNA-210在MPNST細胞中調(diào)控的靶基因。 (2).研究miRNA-210在MPNST細胞中調(diào)控EFNA3基因的分子機制。 方法和結(jié)果： (1).通過實時定量PCR檢測rniRNA-210在MPNST細胞系ST88-14和sNF96.2細胞中對潛在的靶基因包括EFNA3、MNT、 AIFM3、ZNF462、GIT2(PKL)的表達水平的影響,結(jié)果表明在ST88-14和sNF96.2細胞中EFNA3表達顯著降低。 (2).生物信息學(xué)對EFNA3基因mRNA的3’非翻譯區(qū)進行分析,識別了一個潛在的miRNA-210結(jié)合位點。 (3).分別將野生型以及突變了miRNA-210結(jié)合位點的EFNA3基因mRNA的3’非翻譯區(qū)序列克隆進入報告基因載體psi-CHECK2,命名為EFNA3-3'UTR-psi-CHECK2和Mut-EFNA3-3'UTR-psi-CHECK2。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒?發(fā)現(xiàn)rmiRNA-210能夠顯著的抑制野生型報告基因載體EFNA3-3'UTR-psi-CHECK2的熒光素酶活性,而對突變型報告基因載體Mut-EFNA3-3'UTR-psi-CHECK2的熒光素酶活性沒有影響。 (4).通過RT-PCR和western blot分析anti-miRNA-210、 pre-miRNA-210或相應(yīng)對照在MPNST細胞系ST88-14和sNF96.2細胞中EFNA3基因的表達。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染pre-miRNA-210進入ST88-14和sNF96.2細胞中能夠顯著增加rmiRNA-210和減少EFNA3mRNA水平。然而,轉(zhuǎn)染anti-miRNA-210進入ST88-14和sNF96.2細胞中則減少miRNA-210和增加了EFNA3mRNA水平。 結(jié)論： MiRNA-210能夠靶向調(diào)節(jié)EFNA3基因的表達,暗示了miRNA-210可能通過靶向抑制EFNA3基因的表達調(diào)節(jié)MPNST細胞的增殖和侵襲。 第三部分.MiRNA-210介導(dǎo)的EFNA3基因的抑制在MPNST細胞增殖和侵襲中的作用 目的： 研究miRNA-210介導(dǎo)的EFNA3基因的抑制在MPNST細胞增殖和侵襲中的作用。 方法和結(jié)果： (1).分別構(gòu)建EFNA3-Talen (L)和EFNA3-Talen (L)載體,并將兩個載體一起分別轉(zhuǎn)染進入MPNST細胞系ST88-14和sNF96.2細胞中,分別構(gòu)建EFNA3敲除細胞系包括ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen。 (2).通過MTT分析miRNA-210過表達對EFNA3敲除細胞系包括ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen穩(wěn)定細胞系以及對照細胞增殖能力的影響。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miRNA-210進入ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen穩(wěn)定細胞系后的增殖速度并不快于miRNA-210轉(zhuǎn)染的對照細胞。 (3).通過Transwell實驗分析miRNA-210過表達對空白細胞或EFNA3敲除細胞系包括ST88-14-EFNA3-Talen和sNF96.2-EFNA3-Talen穩(wěn)定細胞系侵襲能力的影響。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miRNA-210的EFNA3敲除細胞系的侵襲能力強于轉(zhuǎn)染miRNA-210的空白對照細胞系。 結(jié)論： MiRNA-210誘導(dǎo)的EFNA3表達抑制只是部分促進了MPNST細胞的增殖。MiRNA-210的靶基因EFNA3參與了MPNST侵襲的抑制。 主要創(chuàng)新點： 1.首次研究了niRNA-210促進MPNST細胞增殖和侵潤中的作用。 2.首次發(fā)現(xiàn)miRNA-210在MPNST細胞中負調(diào)控了EFNA3基因的表達。 3.首次研究了miRNA-210/EFNA3在MPNST增殖和侵潤中的作用,暗示了miRNA-210/EFNA3可能能夠作為治療MPNST的靶。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;Induction, modulation and potential targets of miR-210 in pancreatic cancer cells[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2012年03期

2 陳飛宇;楊智云;;惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤的MRI診斷[J];臨床放射學(xué)雜志;2013年05期

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本文編號：2327762