【摘要】：目的人腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,惡性膠質(zhì)瘤的侵襲和復(fù)發(fā)率都明顯高于顱內(nèi)其他腫瘤。特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)預(yù)后差、易復(fù)發(fā),嚴(yán)重影響患者生活和生存質(zhì)量,其中GBM患者中位生存期在1年左右。在當(dāng)前精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的指導(dǎo)下,傳統(tǒng)的腫瘤分型正逐步轉(zhuǎn)向以分子遺傳特征為基礎(chǔ)的新診斷體系。癌癥基因組圖譜計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)研究結(jié)果表明,包括表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)、β-連環(huán)素(β-catenin)、非編碼RNA HOTAIR為代表的多個(gè)癌基因突變、擴(kuò)增是人腦膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的重要分子事件。當(dāng)前觀點(diǎn)認(rèn)為,Wnt/β-catenin等在內(nèi)的多個(gè)信號(hào)通路與EGFR信號(hào)通路之間的協(xié)同作用和交互調(diào)節(jié)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤向快速生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)變,也是惡性膠質(zhì)瘤治療失敗的重要原因。因此,尋找膠質(zhì)瘤中EGFRwt/vIII與β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因及其分子機(jī)制,成為影響膠質(zhì)瘤靶向治療效果關(guān)鍵所在。方法1、對(duì)中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)和TCGA提供的人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析HOTAIR表達(dá);收集整理CGGA提供膠質(zhì)瘤標(biāo)本的性別、KPS評(píng)分等數(shù)據(jù);隨訪CGGA生存期;焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)CGGA所有標(biāo)本中異檸檬酸脫氫酶同工酶1(IDH1)和甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)突變頻率;免疫組織化學(xué)染色化學(xué)染色法檢測(cè)MGMT、人增殖細(xì)胞核核抗原(Ki-67)、EGFR、人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)表達(dá);Cox回歸分析HOTAIR表達(dá)與膠質(zhì)瘤標(biāo)本臨床特征關(guān)系。2、U87人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞經(jīng)表達(dá)HOTAIR干擾RNA的慢病毒載體(Lenti-HOTAIR si)侵染48h后,提取總RNA,使用Illumina HiSeqTM 2000系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序,篩選差異表達(dá)基因。篩選Nemo樣激酶(Nemo-like kinase,NLK)作為HOTAIR靶基因。3、Lenti-HOTAIR si轉(zhuǎn)染U87和U87vIII細(xì)胞,蛋白印跡(Western blot)檢測(cè)Nemo樣激酶(Nemo-like kinase,NLK)表達(dá);染色體免疫共沉淀法檢測(cè)免疫共沉淀法檢測(cè)HOTAIR調(diào)控NLK轉(zhuǎn)錄;免疫共沉淀PKM2與β-catenin相互作用;熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄活性變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲低hotair后gbm細(xì)胞周期變化;克隆形成實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)gbm侵襲、遷移能力變化;wb檢測(cè)細(xì)胞周期、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)變化。4、建立不同hotair表達(dá)水平的u87和u87viiigbm裸鼠顱內(nèi)模型,使用小動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤大小;he染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化,免疫組化檢測(cè)ki-67、nlk、p21等蛋白表達(dá)變化。結(jié)果1、通過對(duì)cgga中310例膠質(zhì)瘤和5例正常腦組織標(biāo)本中hotair表達(dá)狀態(tài)的分析顯示,hotair在gbm中表達(dá)高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤(lowgradeglioma,lgg)和正常腦組織(p0.05);kaplan-meier生存分析顯示hotair高表達(dá)gbm患者生存較差(p0.05);單因素回歸分析提示hotair表達(dá)與患者確診年齡、mgmt啟動(dòng)子甲基化相關(guān)(p0.05);與性別、kps評(píng)分、是否完整切除、mgmt、pten、ki67表達(dá)無關(guān)(p0.05)。多因素cox回歸分析提示hotair表達(dá)、確診年齡、idh1突變、kps評(píng)分和ki67表達(dá)等與gbm患者總生存負(fù)相關(guān)(p0.05)。2、通過對(duì)比是否轉(zhuǎn)染lenti-hotairsi的u87mg細(xì)胞rna測(cè)序結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)1288個(gè)過表達(dá)基因和1628個(gè)低表達(dá)基因。通過比對(duì)cgga數(shù)據(jù)庫,初步鑒定nlk是hotair下游候選靶基因。nlk表達(dá)在高級(jí)膠質(zhì)瘤(highgradeglioma,hgg)中表達(dá)較lgg降低(p0.05);就cgga數(shù)據(jù)庫中g(shù)bm標(biāo)本中hotair與nlk表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=0.156,p0.05)。westernblot證實(shí),敲低hotair表達(dá)后,nlk表達(dá)升高;chip-pcr證實(shí),h3k27me3在nlk5'非翻譯區(qū)(5'utr)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3kb范圍內(nèi)有結(jié)合位點(diǎn),hotair抑制nlk轉(zhuǎn)錄。3、敲低u87mg和u87viiimg細(xì)胞中hotair表達(dá)后,top-fop熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí),β-catenin轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)(p0.05);總β-catenin(-p)和組分蛋白β-catenin(-p)表達(dá)下調(diào)(p0.05);細(xì)胞周期阻滯于g1期;rb(-p)、p21和p16表達(dá)升高;cyclind1、e2f1表達(dá)降低(p0.05);2-d基質(zhì)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)示gbm細(xì)胞敲低hotair細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)、增殖能力下降(p0.05);transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低hotair后gbm細(xì)胞侵襲、遷移能力下降(p0.05);westernblott提示e-cadherin表達(dá)升高;n-cadherin、nf-κb、zeb-1、twist-1表達(dá)下降(p0.05)。4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,敲低HOTAIR表達(dá)的U87MG和U87vIIIMG裸鼠顱內(nèi)生存期高于對(duì)照組(P0.05);小動(dòng)物成像和HE染色提示Lenti-HOTAIR si轉(zhuǎn)染組腫瘤體積小于對(duì)照組(P0.05);IHC檢測(cè)提示:敲低HOTAIR表達(dá)后,NLK和p21表達(dá)升高;Ki67、β-catenin、Slug表達(dá)降低。結(jié)論綜上所述,本研究首次鑒定膠質(zhì)瘤中非編碼RNA HOTAIR下游靶基因,且初步闡述膠質(zhì)瘤中HOTAIR參與調(diào)控β-catenin信號(hào)通路的生物學(xué)功能以及作為治療靶點(diǎn)前的前景。具有以下三個(gè)重要的理論方法和實(shí)踐意義:(1)首次應(yīng)用通過對(duì)比CGGA數(shù)據(jù)庫和體外細(xì)胞系中RNA-seq數(shù)據(jù),篩選出候選靶基因;為今后開展針對(duì)LncRNA的基礎(chǔ)研究提供方法學(xué)依據(jù);(2)通過基于H3K27me3的CHIP-PCR方法鑒定膠質(zhì)瘤中HOTAIR參與抑制NLK轉(zhuǎn)錄的具體位點(diǎn)和機(jī)制;(3)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明干擾HOTAIR表達(dá),可以抑制不同EGFR狀態(tài)GBM細(xì)胞細(xì)胞周期演進(jìn)、侵襲、遷移能力;干擾β-catenin通路的激活及生物學(xué)效應(yīng);HOTAIR是一個(gè)頗具治療前景的候選靶基因。本研究結(jié)果有助于我們初步了解膠質(zhì)瘤中最具特點(diǎn)的癌LncRNA的作用機(jī)制,為從RNA角度揭示膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制、優(yōu)化膠質(zhì)瘤治療策略提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Lihua Huang;Liwu Fu;;Mechanisms of resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2015年05期

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本文編號(hào)：2316754