發(fā)布時(shí)間：2018-10-29 20:56

【摘要】：紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路信號(hào)的傳入及整合中心,其在調(diào)節(jié)機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能中發(fā)揮重要的作用。來(lái)自皮層以及下丘腦的信號(hào)傳入,經(jīng)過(guò)紋狀體局部環(huán)路后傳出到蒼白球或者黑質(zhì)網(wǎng)狀部。紋狀體功能的異常與許多運(yùn)動(dòng)功能障礙疾病相關(guān),如帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD),亨廷頓舞蹈癥(Huntington’s Disease,HD)以及多動(dòng)癥(Attention Deficit Hyperactivity Disorder,ADHD)等。紋狀體中包含有五種神經(jīng)元,占比95%的中等棘狀神經(jīng)元(Medium Spiny Neurons,MSNs),占比1-3%的膽堿能中間神經(jīng)元(Cholinergic Interneuron,Ch Is)以及剩下的g-氨基丁酸能(g-aminobutyric acid,GABAergic)中間神經(jīng)元(其分別包括表達(dá)細(xì)小白蛋白,神經(jīng)肽Y以及鈣網(wǎng)膜結(jié)合蛋白的中間神經(jīng)元)。已有文獻(xiàn)報(bào)道Ch Is具有自發(fā)放電特性,其是紋狀體內(nèi)唯一能合成乙酰膽堿(Acetycholine,ACh)的神經(jīng)元,其通過(guò)自身合成并釋放的ACh來(lái)調(diào)節(jié)紋狀體傳出神經(jīng)元MSNs的生理活動(dòng),從而參與機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)控。毒蕈堿型膽堿受體(Muscarinic acetycholine receptor,m ACh R)廣泛分布在紋狀體內(nèi),在Ch Is上亦有大量表達(dá),而其是否作為自身受體受體參與對(duì)Ch Is的調(diào)節(jié)過(guò)程尚不明確。HCN通道(Hyperpolarizationactivated Cyclic Nucleotide-gated channels)是一種超極化激活的環(huán)核苷酸門(mén)控的非選擇性陽(yáng)離子通道,特異性高表達(dá)在外周心臟組織以及腦內(nèi)少數(shù)核團(tuán)。HCN通道電流(hyperpolarization-activated current,Ih)又叫起搏電流,其參與調(diào)控神經(jīng)元興奮性以及自發(fā)節(jié)律的過(guò)程。Ch Is電生理記錄到大幅度的Ih,而其所表達(dá)的通道亞型尚不明確。本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖顷U明Ch Is胞體所表達(dá)的M受體以及HCN通道亞型,探究外源性M受體激動(dòng)劑及其自身合成并釋放的ACh是否能夠通過(guò)自身M膽堿受體來(lái)影響HCN通道進(jìn)而調(diào)節(jié)Ch Is的生理活動(dòng),并闡明其調(diào)節(jié)作用的生理機(jī)制。結(jié)果如下:1,我們結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué),電生理學(xué),免疫組織化學(xué),單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)(single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,sc RT-PCR)確證我們選擇的每個(gè)神經(jīng)元是Ch Is。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)Ch Is具有30-50mm的胞體直徑以及粗而壯的神經(jīng)元突起,電生理學(xué)發(fā)現(xiàn)Ch Is具有特有的標(biāo)志性的電生理活動(dòng),sc RT-PCR以及免疫組化發(fā)現(xiàn)Ch Is特異性表達(dá)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cholineacetyltransferase,Ch AT)。2,注入去極化的電流能夠誘發(fā)Ch Is規(guī)律性放電,撤去電流后細(xì)胞發(fā)生后超極化。超極化的電流能夠誘發(fā)細(xì)胞膜電位超極化,并產(chǎn)生sag。在腦片中,絕大多數(shù)神經(jīng)元都具有自發(fā)放電特性。Ch Is有三種自發(fā)放電模式,規(guī)律性放電,不規(guī)律性放電以及爆發(fā)式放電。這三種放電模式在一定程度上會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。3,電生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Ch Is能夠記錄到明顯的Ih,其能夠被HCN通道阻斷劑ZD7288(30mM)以及Cs+(1 m M)分別阻斷94.50%±0.99%(n=7)以及90.74%±1.13%(n=5)。HCN通道在Ch Is自發(fā)放電過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,在加入HCN通道阻斷劑ZD7288(30mM)后,細(xì)胞出現(xiàn)不連續(xù)的超極化過(guò)程。這種超極化不受TTX敏感的Na+通道調(diào)節(jié)。加入ZD7288后,細(xì)胞自發(fā)放電頻率由2.44±0.71 Hz減小到1.72±0.48 Hz。Ch Is自發(fā)放電模式由規(guī)律性放電轉(zhuǎn)變成爆發(fā)式放電并誘發(fā)神經(jīng)元振蕩放電,描述神經(jīng)元放電規(guī)律性的變異系數(shù)(CV)由0.46±0.16增大到2.67±1.46。4,采用sc RT-PCR研究發(fā)現(xiàn),HCN的四種亞型在Ch Is上均有轉(zhuǎn)錄。其中HCN2以及HCN3在每一個(gè)檢測(cè)(27/27)的Ch Is中均檢測(cè)到。HCN4在檢測(cè)的神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)錄比稍微低一些(26/27),而HCN1的轉(zhuǎn)錄比則最低,僅為11/27。半定量RT-PCR結(jié)果表明HCN2,HCN3,HCN4的檢測(cè)閾值均符合高斯分布擬合,而HCN1由于含量太低不能采用高斯曲線(xiàn)擬合。結(jié)果表明,HCN2的中心檢測(cè)閾值為2-5而HCN3以及HCN4的檢測(cè)閾值都為2-3。免疫熒光化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,在蛋白水平上HCN2高表達(dá),而HCN1信號(hào)則很弱。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在Ch Is細(xì)胞上HCN2是主要表達(dá)的HCN通道亞型。5,電生理學(xué)研究表明,外源性添加非選擇性膽堿受體激動(dòng)劑ACh?Cl(50μM)能夠明顯抑制Ch Is神經(jīng)元的自發(fā)放電。細(xì)胞放電頻率由fcontrol=1.88±0.44 Hz減少為fACh·Cl=1.13±0.38 Hz(n=6,p0.05)。描述放電規(guī)律性的變異系數(shù)CV值由給藥前的0.38±0.14增大到給藥后的0.54±0.20(n=6,p0.01)。M膽堿受體激動(dòng)劑OXO-M也同樣抑制Ch Is神經(jīng)元的自發(fā)放電,放電頻率由fcontrol=1.62±0.67 Hz減小為fOXO-M=0.93±0.35 Hz(n=11,p0.01)。CV值同樣由給藥前的0.41±0.09增大到給藥后的0.65±0.13(n=11,p0.001)。加入OXO-M后,Ch Is細(xì)胞的超極化時(shí)間明顯延長(zhǎng)。加入M膽堿受體拮抗劑SCO后細(xì)胞的自發(fā)放電頻率沒(méi)有發(fā)生明顯的變化(fcontrol=1.75±0.61 Hz,f SCO=2.31±0.91 Hz,n=9,p0.05)。在SCO與OXO-M共同給藥時(shí),OXO-M對(duì)Ch Is的抑制作用被阻斷(fcontrol=1.75±0.61 Hz,fSCO+OXO-M=2.35±1.10 Hz,n=9,p0.05)。細(xì)胞的放電模式?jīng)]有被改變,CV值在加入SCO以及SCO與OXO-M共同作用時(shí)均沒(méi)有發(fā)生明顯的變化(CVcontrol=0.38±0.08,CVSCO=0.35±0.05,CVSCO+OXO-M=0.37±0.09,n=9,p0.05)。這些結(jié)果表明激活M膽堿受體抑制Ch Is細(xì)胞的自發(fā)放電過(guò)程。6,文獻(xiàn)報(bào)道M受體能夠調(diào)節(jié)許多離子通道從而影響細(xì)胞的生理活性。本研究發(fā)現(xiàn)OXO-M能夠顯著抑制Ih。這種抑制作用與時(shí)間以及電壓呈現(xiàn)相關(guān)性。在-140 m V的超極化電壓刺激時(shí),Ih幅度在加入OXO-M后減小21.1%±8.5%(n=9,p0.01)。在加入OXO-M后,HCN通道尾電流的半數(shù)激活電壓從-102.4±2.11 m V超極化為-107.4±2.25 m V(n=9,p0.01)。SCO加入后,OXO-M對(duì)Ih的作用沒(méi)有時(shí)間以及電壓相關(guān)性。在最大超極化電壓(-140 m V)時(shí),OXO-M對(duì)Ih的抑制作用被SCO阻斷(99.2%±0.03%of control,n=5,p0.05)。SCO本身對(duì)Ih幅度以及HCN通道尾電流的半數(shù)激活電壓沒(méi)有明顯的作用,共同加入SCO時(shí),OXO-M對(duì)Ih的半數(shù)激活電壓沒(méi)有向超極化方向改變(V1/2 in control,-105.7±2.23 m V;V1/2 in SCO,-104.0±1.76 m V;V1/2 in SCO+OXO-M,-104.5±2.50 m V;n=5,p0.05)。以上結(jié)果表明OXO-M是通過(guò)激活M膽堿受體來(lái)間接改變Ih幅度以及HCN通道的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。7,為了確證是哪種M膽堿受體參與OXO-M對(duì)HCN通道的抑制作用,我們首先采用sc RT-PCR闡明M受體亞型的表達(dá)。結(jié)果表明,在Ch Is胞體上五種M膽堿受體均有轉(zhuǎn)錄。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,M2在每一個(gè)(32/32)檢測(cè)的神經(jīng)元中均有轉(zhuǎn)錄,而M4在檢測(cè)的神經(jīng)元中有20/32檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄。M1樣膽堿受體(M1,M3,M5)在檢測(cè)的Ch Is中的轉(zhuǎn)錄比分別為28/32,18/32,26/32。半定量RT-PCR研究表明,M1及M2的檢測(cè)稀釋閾值能夠用高斯分布曲線(xiàn)擬合,M1的檢測(cè)閾值為2-3而M2的檢測(cè)閾值2-8。M3,M4,M5由于含量較低,其分布曲線(xiàn)不符合高斯分布而無(wú)法擬合出其檢測(cè)閾值。同樣在蛋白水平的免疫熒光化學(xué)實(shí)驗(yàn)證明相對(duì)高轉(zhuǎn)錄的M2受體在Ch Is細(xì)胞上高表達(dá),而M4受體免疫熒光信號(hào)則相對(duì)很弱。綜上,M2受體是Ch Is細(xì)胞上相對(duì)高表達(dá)的M膽堿受體亞型。8,電生理實(shí)驗(yàn)表明Ch Is細(xì)胞上的Ih對(duì)c AMP高度敏感,在加入c AMP類(lèi)似物后8-Br-c AMP(100μM),Ih幅度增大為給藥前的126.8%±8.0%(n=4,p0.01)。在加入c AMP競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑Rp-c AMP(50μM)后,Ih幅度明顯減小(82.6%±4.5%of control,n=4,p0.01)。在加入M2樣受體拮抗劑AF-DX384(1μM)后,Ih沒(méi)有發(fā)生明顯的改變(97.0%±3.8%of control,n=8,p0.05)。繼續(xù)加入OXO-M(10μM)后,Ih也沒(méi)有發(fā)生明顯的變化(94.3%±5.5%of control,n=6,p0.05)。在加入G蛋白的阻斷劑GDP-β-S(0.5μM)后,OXO-M對(duì)Ih的抑制作用被阻斷(95.4%±7.3%of control,n=7,p0.05)。c AMP依賴(lài)的蛋白激酶阻斷劑H-89對(duì)Ih沒(méi)有明顯作用(96.2%±5.5%of control,n=7,p0.05),而當(dāng)OXO-M與H-89共同加入浴液中時(shí),OXO-M對(duì)Ih的抑制作用并沒(méi)有被明顯的影響(84.4%±3.8%of control,n=11,p0.01)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OXO-M對(duì)HCN通道的抑制作用是通過(guò)不依賴(lài)于PKA蛋白激酶的c AMP信號(hào)通路而發(fā)揮作用的。9,在誘發(fā)放電狀態(tài)下(I=0.06 n A),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加入SCO(30μM)后細(xì)胞放電頻率明顯增加,由基礎(chǔ)狀態(tài)的3.14?0.46 Hz增加到給藥后的4.30?1.37 Hz(*p0.05,n=7)。變異系數(shù)CV值由給藥前的0.89?0.18減小為給藥后的0.72?0.12(*p0.01,n=7)。這個(gè)結(jié)果表明在自發(fā)狀態(tài)下,Ch Is釋放的ACh濃度較低而沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的自身調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明Ch Is細(xì)胞上表達(dá)有四種HCN通道亞型以及五種M膽堿受體亞型,其中HCN2以及M2為主要表達(dá)的亞型種類(lèi)。HCN通道在調(diào)節(jié)Ch Is細(xì)胞自發(fā)放電過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,其主要通過(guò)調(diào)節(jié)Ch Is超極化的時(shí)程來(lái)影響Ch Is的自發(fā)放電頻率。激活Ch Is胞體上的M膽堿受體能抑制Ch Is細(xì)胞的自發(fā)放電,其主要通過(guò)胞膜上的M2樣受體介導(dǎo)。M受體通過(guò)c AMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)胞內(nèi)的c AMP濃度來(lái)調(diào)節(jié)HCN通道活性,從而調(diào)節(jié)Ch Is的自發(fā)放電活性。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,腦片內(nèi)的Ch Is細(xì)胞自發(fā)釋放的ACh濃度較低,加入SCO阻斷后腦片記錄不足以觀(guān)察到其自身的調(diào)節(jié)作用。誘發(fā)放電狀態(tài)下,細(xì)胞的釋放的ACh增多,其自我調(diào)節(jié)作用增強(qiáng),加入SCO后能觀(guān)察到明顯的生理活動(dòng)變化。本研究結(jié)果表明Ch Is自身表達(dá)的M受體能夠通過(guò)調(diào)節(jié)HCN通道來(lái)改變Ch Is細(xì)胞的電生理活動(dòng),這為闡明M受體在機(jī)體內(nèi)參與運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)控提供一個(gè)新的角度。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5

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本文編號(hào)：2298801