【摘要】：紋狀體是基底神經節(jié)環(huán)路信號的傳入及整合中心,其在調節(jié)機體運動功能中發(fā)揮重要的作用。來自皮層以及下丘腦的信號傳入,經過紋狀體局部環(huán)路后傳出到蒼白球或者黑質網狀部。紋狀體功能的異常與許多運動功能障礙疾病相關,如帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD),亨廷頓舞蹈癥(Huntington’s Disease,HD)以及多動癥(Attention Deficit Hyperactivity Disorder,ADHD)等。紋狀體中包含有五種神經元,占比95%的中等棘狀神經元(Medium Spiny Neurons,MSNs),占比1-3%的膽堿能中間神經元(Cholinergic Interneuron,Ch Is)以及剩下的g-氨基丁酸能(g-aminobutyric acid,GABAergic)中間神經元(其分別包括表達細小白蛋白,神經肽Y以及鈣網膜結合蛋白的中間神經元)。已有文獻報道Ch Is具有自發(fā)放電特性,其是紋狀體內唯一能合成乙酰膽堿(Acetycholine,ACh)的神經元,其通過自身合成并釋放的ACh來調節(jié)紋狀體傳出神經元MSNs的生理活動,從而參與機體運動功能的調控。毒蕈堿型膽堿受體(Muscarinic acetycholine receptor,m ACh R)廣泛分布在紋狀體內,在Ch Is上亦有大量表達,而其是否作為自身受體受體參與對Ch Is的調節(jié)過程尚不明確。HCN通道(Hyperpolarizationactivated Cyclic Nucleotide-gated channels)是一種超極化激活的環(huán)核苷酸門控的非選擇性陽離子通道,特異性高表達在外周心臟組織以及腦內少數(shù)核團。HCN通道電流(hyperpolarization-activated current,Ih)又叫起搏電流,其參與調控神經元興奮性以及自發(fā)節(jié)律的過程。Ch Is電生理記錄到大幅度的Ih,而其所表達的通道亞型尚不明確。本研究的實驗目的是闡明Ch Is胞體所表達的M受體以及HCN通道亞型,探究外源性M受體激動劑及其自身合成并釋放的ACh是否能夠通過自身M膽堿受體來影響HCN通道進而調節(jié)Ch Is的生理活動,并闡明其調節(jié)作用的生理機制。結果如下:1,我們結合細胞形態(tài)學,電生理學,免疫組織化學,單細胞RT-PCR技術(single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,sc RT-PCR)確證我們選擇的每個神經元是Ch Is。細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)Ch Is具有30-50mm的胞體直徑以及粗而壯的神經元突起,電生理學發(fā)現(xiàn)Ch Is具有特有的標志性的電生理活動,sc RT-PCR以及免疫組化發(fā)現(xiàn)Ch Is特異性表達膽堿乙酰轉移酶(Cholineacetyltransferase,Ch AT)。2,注入去極化的電流能夠誘發(fā)Ch Is規(guī)律性放電,撤去電流后細胞發(fā)生后超極化。超極化的電流能夠誘發(fā)細胞膜電位超極化,并產生sag。在腦片中,絕大多數(shù)神經元都具有自發(fā)放電特性。Ch Is有三種自發(fā)放電模式,規(guī)律性放電,不規(guī)律性放電以及爆發(fā)式放電。這三種放電模式在一定程度上會發(fā)生相互轉化。3,電生理學研究發(fā)現(xiàn)Ch Is能夠記錄到明顯的Ih,其能夠被HCN通道阻斷劑ZD7288(30mM)以及Cs+(1 m M)分別阻斷94.50%±0.99%(n=7)以及90.74%±1.13%(n=5)。HCN通道在Ch Is自發(fā)放電過程中發(fā)揮重要的作用,在加入HCN通道阻斷劑ZD7288(30mM)后,細胞出現(xiàn)不連續(xù)的超極化過程。這種超極化不受TTX敏感的Na+通道調節(jié)。加入ZD7288后,細胞自發(fā)放電頻率由2.44±0.71 Hz減小到1.72±0.48 Hz。Ch Is自發(fā)放電模式由規(guī)律性放電轉變成爆發(fā)式放電并誘發(fā)神經元振蕩放電,描述神經元放電規(guī)律性的變異系數(shù)(CV)由0.46±0.16增大到2.67±1.46。4,采用sc RT-PCR研究發(fā)現(xiàn),HCN的四種亞型在Ch Is上均有轉錄。其中HCN2以及HCN3在每一個檢測(27/27)的Ch Is中均檢測到。HCN4在檢測的神經元中的轉錄比稍微低一些(26/27),而HCN1的轉錄比則最低,僅為11/27。半定量RT-PCR結果表明HCN2,HCN3,HCN4的檢測閾值均符合高斯分布擬合,而HCN1由于含量太低不能采用高斯曲線擬合。結果表明,HCN2的中心檢測閾值為2-5而HCN3以及HCN4的檢測閾值都為2-3。免疫熒光化學實驗結果證明,在蛋白水平上HCN2高表達,而HCN1信號則很弱。以上實驗結果表明,在Ch Is細胞上HCN2是主要表達的HCN通道亞型。5,電生理學研究表明,外源性添加非選擇性膽堿受體激動劑ACh?Cl(50μM)能夠明顯抑制Ch Is神經元的自發(fā)放電。細胞放電頻率由fcontrol=1.88±0.44 Hz減少為fACh·Cl=1.13±0.38 Hz(n=6,p0.05)。描述放電規(guī)律性的變異系數(shù)CV值由給藥前的0.38±0.14增大到給藥后的0.54±0.20(n=6,p0.01)。M膽堿受體激動劑OXO-M也同樣抑制Ch Is神經元的自發(fā)放電,放電頻率由fcontrol=1.62±0.67 Hz減小為fOXO-M=0.93±0.35 Hz(n=11,p0.01)。CV值同樣由給藥前的0.41±0.09增大到給藥后的0.65±0.13(n=11,p0.001)。加入OXO-M后,Ch Is細胞的超極化時間明顯延長。加入M膽堿受體拮抗劑SCO后細胞的自發(fā)放電頻率沒有發(fā)生明顯的變化(fcontrol=1.75±0.61 Hz,f SCO=2.31±0.91 Hz,n=9,p0.05)。在SCO與OXO-M共同給藥時,OXO-M對Ch Is的抑制作用被阻斷(fcontrol=1.75±0.61 Hz,fSCO+OXO-M=2.35±1.10 Hz,n=9,p0.05)。細胞的放電模式沒有被改變,CV值在加入SCO以及SCO與OXO-M共同作用時均沒有發(fā)生明顯的變化(CVcontrol=0.38±0.08,CVSCO=0.35±0.05,CVSCO+OXO-M=0.37±0.09,n=9,p0.05)。這些結果表明激活M膽堿受體抑制Ch Is細胞的自發(fā)放電過程。6,文獻報道M受體能夠調節(jié)許多離子通道從而影響細胞的生理活性。本研究發(fā)現(xiàn)OXO-M能夠顯著抑制Ih。這種抑制作用與時間以及電壓呈現(xiàn)相關性。在-140 m V的超極化電壓刺激時,Ih幅度在加入OXO-M后減小21.1%±8.5%(n=9,p0.01)。在加入OXO-M后,HCN通道尾電流的半數(shù)激活電壓從-102.4±2.11 m V超極化為-107.4±2.25 m V(n=9,p0.01)。SCO加入后,OXO-M對Ih的作用沒有時間以及電壓相關性。在最大超極化電壓(-140 m V)時,OXO-M對Ih的抑制作用被SCO阻斷(99.2%±0.03%of control,n=5,p0.05)。SCO本身對Ih幅度以及HCN通道尾電流的半數(shù)激活電壓沒有明顯的作用,共同加入SCO時,OXO-M對Ih的半數(shù)激活電壓沒有向超極化方向改變(V1/2 in control,-105.7±2.23 m V;V1/2 in SCO,-104.0±1.76 m V;V1/2 in SCO+OXO-M,-104.5±2.50 m V;n=5,p0.05)。以上結果表明OXO-M是通過激活M膽堿受體來間接改變Ih幅度以及HCN通道的動力學性質。7,為了確證是哪種M膽堿受體參與OXO-M對HCN通道的抑制作用,我們首先采用sc RT-PCR闡明M受體亞型的表達。結果表明,在Ch Is胞體上五種M膽堿受體均有轉錄。統(tǒng)計學分析表明,M2在每一個(32/32)檢測的神經元中均有轉錄,而M4在檢測的神經元中有20/32檢測到轉錄。M1樣膽堿受體(M1,M3,M5)在檢測的Ch Is中的轉錄比分別為28/32,18/32,26/32。半定量RT-PCR研究表明,M1及M2的檢測稀釋閾值能夠用高斯分布曲線擬合,M1的檢測閾值為2-3而M2的檢測閾值2-8。M3,M4,M5由于含量較低,其分布曲線不符合高斯分布而無法擬合出其檢測閾值。同樣在蛋白水平的免疫熒光化學實驗證明相對高轉錄的M2受體在Ch Is細胞上高表達,而M4受體免疫熒光信號則相對很弱。綜上,M2受體是Ch Is細胞上相對高表達的M膽堿受體亞型。8,電生理實驗表明Ch Is細胞上的Ih對c AMP高度敏感,在加入c AMP類似物后8-Br-c AMP(100μM),Ih幅度增大為給藥前的126.8%±8.0%(n=4,p0.01)。在加入c AMP競爭性拮抗劑Rp-c AMP(50μM)后,Ih幅度明顯減小(82.6%±4.5%of control,n=4,p0.01)。在加入M2樣受體拮抗劑AF-DX384(1μM)后,Ih沒有發(fā)生明顯的改變(97.0%±3.8%of control,n=8,p0.05)。繼續(xù)加入OXO-M(10μM)后,Ih也沒有發(fā)生明顯的變化(94.3%±5.5%of control,n=6,p0.05)。在加入G蛋白的阻斷劑GDP-β-S(0.5μM)后,OXO-M對Ih的抑制作用被阻斷(95.4%±7.3%of control,n=7,p0.05)。c AMP依賴的蛋白激酶阻斷劑H-89對Ih沒有明顯作用(96.2%±5.5%of control,n=7,p0.05),而當OXO-M與H-89共同加入浴液中時,OXO-M對Ih的抑制作用并沒有被明顯的影響(84.4%±3.8%of control,n=11,p0.01)。以上實驗結果表明OXO-M對HCN通道的抑制作用是通過不依賴于PKA蛋白激酶的c AMP信號通路而發(fā)揮作用的。9,在誘發(fā)放電狀態(tài)下(I=0.06 n A),實驗結果表明加入SCO(30μM)后細胞放電頻率明顯增加,由基礎狀態(tài)的3.14?0.46 Hz增加到給藥后的4.30?1.37 Hz(*p0.05,n=7)。變異系數(shù)CV值由給藥前的0.89?0.18減小為給藥后的0.72?0.12(*p0.01,n=7)。這個結果表明在自發(fā)狀態(tài)下,Ch Is釋放的ACh濃度較低而沒有表現(xiàn)出明顯的自身調節(jié)作用。本研究結果表明Ch Is細胞上表達有四種HCN通道亞型以及五種M膽堿受體亞型,其中HCN2以及M2為主要表達的亞型種類。HCN通道在調節(jié)Ch Is細胞自發(fā)放電過程中發(fā)揮重要的作用,其主要通過調節(jié)Ch Is超極化的時程來影響Ch Is的自發(fā)放電頻率。激活Ch Is胞體上的M膽堿受體能抑制Ch Is細胞的自發(fā)放電,其主要通過胞膜上的M2樣受體介導。M受體通過c AMP信號通路調節(jié)胞內的c AMP濃度來調節(jié)HCN通道活性,從而調節(jié)Ch Is的自發(fā)放電活性。在基礎狀態(tài)下,腦片內的Ch Is細胞自發(fā)釋放的ACh濃度較低,加入SCO阻斷后腦片記錄不足以觀察到其自身的調節(jié)作用。誘發(fā)放電狀態(tài)下,細胞的釋放的ACh增多,其自我調節(jié)作用增強,加入SCO后能觀察到明顯的生理活動變化。本研究結果表明Ch Is自身表達的M受體能夠通過調節(jié)HCN通道來改變Ch Is細胞的電生理活動,這為闡明M受體在機體內參與運動功能的調控提供一個新的角度。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R742.5

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本文編號：2298801