【摘要】：研究背景新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指各種原因所致圍生期窒息、缺氧引起的胎兒或新生兒腦損傷,是新生兒時(shí)期致死和致殘的重要原因之一,臨床上尚缺乏有效的治療措施。缺氧缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死和凋亡是引起腦組織損傷的最重要原因,因此,減少神經(jīng)元壞死和凋亡,促進(jìn)其生存,是防治缺氧缺血所致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要策略之一。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位3(transient receptor potential canonical 3,TRPC3)通道是在胎兒期和圍生期中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)的非特異性陽離子通道,參與包括心腦血管疾病在內(nèi)的體內(nèi)眾多生理和病理過程。有研究證明,TRPC3是細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)者,可以調(diào)節(jié)包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路在內(nèi)的多條鈣敏感胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性,最終影響神經(jīng)元的生存或死亡。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)家族成員。ERK的激活是胞外信號(hào)從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)的關(guān)鍵,因其參與了細(xì)胞增殖、分化、生存與凋亡而受到廣泛關(guān)注。已有證據(jù)表明在缺氧缺血性損傷發(fā)生時(shí),該通路是介導(dǎo)神經(jīng)元生存的重要途徑,當(dāng)其激活時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用,受到抑制時(shí)則可加重腦組織的損傷。ERK信號(hào)通路受到多種因子的調(diào)控,其中胞內(nèi)游離鈣離子濃度是影響ERK活性的重要信號(hào)事件之一。已有研究發(fā)現(xiàn)作為胞內(nèi)鈣離子濃度重要調(diào)節(jié)者的TRPC通道,在多種損傷或刺激因素的作用下,參與了ERK通路的激活,從而發(fā)揮其減少凋亡、促進(jìn)生存的作用。但是關(guān)于TRPC3通道在新生動(dòng)物HIBD中的作用及其與ERK通路關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。本課題圍繞TRPC3通道、Ca~(2+)和ERK信號(hào)通路,初步探討TRPC3在HIBD中的作用及其可能的機(jī)制。第一部分 TRPC3通道對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元OGD/R損傷的保護(hù)作用目的采用原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元OGD/R模型,探討TRPC3通道對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元OGD/R損傷的保護(hù)作用。方法1.模型:對(duì)原代培養(yǎng)的SD大鼠皮層神經(jīng)元,采用氧糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation,OGD)1.5 h復(fù)糖氧24 h的方法制備大鼠皮層神經(jīng)元OGD/R模型。2.分組(1)選擇性阻斷劑Pyr3阻斷TRPC3通道:Control組,Vehicle組,Pyr3(1、5、10、20和30μmol/L)組,OGD/R組,OGD/R+Vehicle組,OGD/R+Pyr3(1、5、10、20和30μmol/L)組。(2)si RNA干擾TRPC3表達(dá):Control組,OGD/R組,OGD/R+si-TRPC3組,OGD/R+si-Scramble組。3.檢測(cè)指標(biāo)(1)MTT法檢測(cè)神經(jīng)元的細(xì)胞存活率;(2)LDH漏出率檢測(cè)細(xì)胞膜完整性;(3)Hochest33342染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡;(4)激光共聚焦檢測(cè)神經(jīng)元的胞內(nèi)鈣離子濃度。結(jié)果相較于OGD/R組,OGD/R+Pyr3組和OGD/R+si-TRPC3組神經(jīng)元存活率明顯降低,LDH漏出率增加,細(xì)胞凋亡率升高且具有劑量依賴性。阻斷TRPC3通道可以降低OGD/R神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度。結(jié)論特異性阻斷TRPC3通道或下調(diào)TRPC3表達(dá)均可明顯加重氧糖剝奪導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷,表明TRPC3通道可能在神經(jīng)元OGD/R損傷中發(fā)揮了保護(hù)作用,這種保護(hù)作用可能和鈣通道調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,維持鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)。第二部分 TRPC3通道對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用目的采用新生大鼠HIBD模型,探討TRPC3通道對(duì)缺氧缺血性損傷所致新生動(dòng)物腦組織損傷的保護(hù)作用。方法1.模型:新生7天SD大鼠,采用右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎和缺氧(92%N2+8%O2)2 h制備HIBD模型。2.分組Sham 組,Vehicle 組,Pyr3(5、10、20 和 40mg/kg)組,HI 組,HI + Vehicle 組,HI + Pyr3(5 和/或 20mg/kg)組3.檢測(cè)指標(biāo)(1)腦組織含水量檢測(cè)腦水腫;(2)TTC染色檢測(cè)腦梗死體積;(3)HE染色觀察腦組織病理損傷;(4)神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)(神經(jīng)功能缺損評(píng)分、平衡木實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn));(5)患/健側(cè)腦重比;(6)TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡率;(7)Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)。結(jié)果與HI組相比,HI+Pyr3-20mg組急性期和長(zhǎng)期神經(jīng)行為學(xué)及腦組織損傷程度明顯加重.神經(jīng)功能缺損評(píng)分、平衡木實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Pyr3特異性阻斷TRPC3導(dǎo)致HIBD動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力的缺損加重,腦組織水含量、TTC染色和患/健側(cè)腦重比顯示Pyr3可增加HI后的腦水腫和梗死體積,加重腦萎縮。TUNEL染色顯示HI+Pyr3-20mg組神經(jīng)元凋亡率較HI組增加。阻斷TRPC3還可以顯著抑制ERK1/2的磷酸化,并可上調(diào)促凋亡蛋白BAX和下調(diào)抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)。結(jié)論1.TRPC3通道參與新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。2.阻斷TRPC3通道可以加重新生大鼠的缺氧缺血性腦損傷,其機(jī)制可能與其對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及ERK信號(hào)通路活性的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2297488