【摘要】：研究背景新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指各種原因所致圍生期窒息、缺氧引起的胎兒或新生兒腦損傷,是新生兒時期致死和致殘的重要原因之一,臨床上尚缺乏有效的治療措施。缺氧缺血誘導的神經元壞死和凋亡是引起腦組織損傷的最重要原因,因此,減少神經元壞死和凋亡,促進其生存,是防治缺氧缺血所致神經系統(tǒng)損傷的重要策略之一。經典瞬時受體電位3(transient receptor potential canonical 3,TRPC3)通道是在胎兒期和圍生期中樞神經系統(tǒng)中廣泛表達的非特異性陽離子通道,參與包括心腦血管疾病在內的體內眾多生理和病理過程。有研究證明,TRPC3是細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的重要調節(jié)者,可以調節(jié)包括細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路在內的多條鈣敏感胞內信號轉導通路的活性,最終影響神經元的生存或死亡。細胞外信號調節(jié)激酶是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)家族成員。ERK的激活是胞外信號從細胞膜轉導至細胞核內的關鍵,因其參與了細胞增殖、分化、生存與凋亡而受到廣泛關注。已有證據表明在缺氧缺血性損傷發(fā)生時,該通路是介導神經元生存的重要途徑,當其激活時具有神經保護作用,受到抑制時則可加重腦組織的損傷。ERK信號通路受到多種因子的調控,其中胞內游離鈣離子濃度是影響ERK活性的重要信號事件之一。已有研究發(fā)現作為胞內鈣離子濃度重要調節(jié)者的TRPC通道,在多種損傷或刺激因素的作用下,參與了ERK通路的激活,從而發(fā)揮其減少凋亡、促進生存的作用。但是關于TRPC3通道在新生動物HIBD中的作用及其與ERK通路關系的研究尚未見報道。本課題圍繞TRPC3通道、Ca~(2+)和ERK信號通路,初步探討TRPC3在HIBD中的作用及其可能的機制。第一部分 TRPC3通道對大鼠皮層神經元OGD/R損傷的保護作用目的采用原代培養(yǎng)皮層神經元OGD/R模型,探討TRPC3通道對大鼠皮層神經元OGD/R損傷的保護作用。方法1.模型:對原代培養(yǎng)的SD大鼠皮層神經元,采用氧糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation,OGD)1.5 h復糖氧24 h的方法制備大鼠皮層神經元OGD/R模型。2.分組(1)選擇性阻斷劑Pyr3阻斷TRPC3通道:Control組,Vehicle組,Pyr3(1、5、10、20和30μmol/L)組,OGD/R組,OGD/R+Vehicle組,OGD/R+Pyr3(1、5、10、20和30μmol/L)組。(2)si RNA干擾TRPC3表達:Control組,OGD/R組,OGD/R+si-TRPC3組,OGD/R+si-Scramble組。3.檢測指標(1)MTT法檢測神經元的細胞存活率;(2)LDH漏出率檢測細胞膜完整性;(3)Hochest33342染色檢測神經元凋亡;(4)激光共聚焦檢測神經元的胞內鈣離子濃度。結果相較于OGD/R組,OGD/R+Pyr3組和OGD/R+si-TRPC3組神經元存活率明顯降低,LDH漏出率增加,細胞凋亡率升高且具有劑量依賴性。阻斷TRPC3通道可以降低OGD/R神經元胞內鈣離子濃度。結論特異性阻斷TRPC3通道或下調TRPC3表達均可明顯加重氧糖剝奪導致的神經元損傷,表明TRPC3通道可能在神經元OGD/R損傷中發(fā)揮了保護作用,這種保護作用可能和鈣通道調節(jié)細胞內鈣離子濃度,維持鈣穩(wěn)態(tài)有關。第二部分 TRPC3通道對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用目的采用新生大鼠HIBD模型,探討TRPC3通道對缺氧缺血性損傷所致新生動物腦組織損傷的保護作用。方法1.模型:新生7天SD大鼠,采用右側頸總動脈結扎和缺氧(92%N2+8%O2)2 h制備HIBD模型。2.分組Sham 組,Vehicle 組,Pyr3(5、10、20 和 40mg/kg)組,HI 組,HI + Vehicle 組,HI + Pyr3(5 和/或 20mg/kg)組3.檢測指標(1)腦組織含水量檢測腦水腫;(2)TTC染色檢測腦梗死體積;(3)HE染色觀察腦組織病理損傷;(4)神經行為學檢測(神經功能缺損評分、平衡木實驗和Morris水迷宮實驗);(5)患/健側腦重比;(6)TUNEL染色檢測神經元凋亡率;(7)Western blotting檢測蛋白表達。結果與HI組相比,HI+Pyr3-20mg組急性期和長期神經行為學及腦組織損傷程度明顯加重.神經功能缺損評分、平衡木實驗和水迷宮實驗結果顯示Pyr3特異性阻斷TRPC3導致HIBD動物的運動協(xié)調能力和空間學習記憶能力的缺損加重,腦組織水含量、TTC染色和患/健側腦重比顯示Pyr3可增加HI后的腦水腫和梗死體積,加重腦萎縮。TUNEL染色顯示HI+Pyr3-20mg組神經元凋亡率較HI組增加。阻斷TRPC3還可以顯著抑制ERK1/2的磷酸化,并可上調促凋亡蛋白BAX和下調抗凋亡蛋白BCL-2的表達。結論1.TRPC3通道參與新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的神經保護作用。2.阻斷TRPC3通道可以加重新生大鼠的缺氧缺血性腦損傷,其機制可能與其對細胞內鈣離子濃度及ERK信號通路活性的調節(jié)作用有關。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742

【參考文獻】

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本文編號：2297488