【摘要】：研究背景 蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是臨床上常見的神經(jīng)外科急癥,占所有中風(fēng)的5%-10%左右。自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的最主要病因是顱內(nèi)動脈瘤破裂(約占80%),隨著技術(shù)的發(fā)展和臨床經(jīng)驗(yàn)的積累,早期夾閉或栓塞動脈瘤避免了動脈瘤再次出血,可明顯降低其死亡率。但是,夾閉或栓塞動脈瘤并不能終止蛛網(wǎng)膜下腔出血的病理生理學(xué)過程,蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦損傷仍然存在或繼續(xù)進(jìn)展,最終導(dǎo)致不良預(yù)后。在過去,腦血管痙攣一直被認(rèn)為是導(dǎo)致高死亡率和高致殘率的主要因素,然而,針對腦血管痙攣的治療在臨床上并未獲得成功。 早期腦損傷(early brain injury, EBI)是指從蛛網(wǎng)膜下腔出血開始至72小時這一時間窗之內(nèi)的腦損傷。早期腦損傷是一個非常復(fù)雜的病理生理學(xué)過程,可能主要與顱內(nèi)壓升高、腦血流量降低、腦灌注壓下降、血腦屏障破壞和腦水腫等有關(guān)。大量的動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)：神經(jīng)炎癥和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞凋亡是早期腦損傷的兩個主要的損傷機(jī)制,但具體的發(fā)生機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。 自噬是溶酶體對自身結(jié)構(gòu)進(jìn)行吞噬降解的過程。研究發(fā)現(xiàn)自噬廣泛存在于正常的生理病理過程中。近年來,自噬與炎癥小體的交互作用被廣泛研究。目前的研究結(jié)果提示,自噬調(diào)控炎癥小體活性可能的機(jī)制是一方面自噬泡通過包裹損傷的線粒體,降低了胞漿中活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的水平,從而影響了NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing3)的激活；另一方面,激活的自噬通過對損傷的線粒體進(jìn)行有調(diào)控地降解和外排,從而降低了損傷的線粒體向胞漿中釋放線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA),進(jìn)而影響了NLRP3炎癥小體對含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)1的激活以及下游白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β的成熟和釋放。而自噬與凋亡也有著密切的關(guān)系,在同一個細(xì)胞中,甚至能夠同時出現(xiàn)自噬和凋亡的形態(tài)學(xué)特征。對自噬活性的調(diào)節(jié),被證明對防止線粒體功能障礙具有保護(hù)作用,并且這一作用與自噬在神經(jīng)退行性病變中的神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)。我們的研究組的前期研究結(jié)果表明,自噬的激活能夠通過影響細(xì)胞凋亡的線粒體途徑,對抗細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。 近年來褪黑素被證明在不同的疾病模型中能夠?qū)ψ允伤狡鸬秸{(diào)節(jié)作用。有研究表明褪黑素促進(jìn)的自噬在缺血再灌注模型中能起到有效的神經(jīng)保護(hù)作用。但褪黑素在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中對自噬水平的影響以及其對神經(jīng)炎癥和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞凋亡的作用依然缺乏深入的研究。 本研究將觀察自噬在早期腦損傷中對神經(jīng)炎癥的作用并研究其可能的機(jī)制,同時探索褪黑素治療后對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中自噬水平的影響,并進(jìn)一步研究這些變化對早期腦損傷中神經(jīng)炎癥和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞凋亡的影響及其可能的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法 第一部分 1.采用線栓穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,成年雄性SD大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組),蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH組)；SAH組按取材時間不同又分為蛛網(wǎng)膜下腔出血后6h組(SAH6h組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血后12h組(SAH12h組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h組(SAH24h組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血48h組(SAH48h組)和蛛網(wǎng)膜下腔出血后72h組(SAH72h組),通過神經(jīng)功能缺陷評分,腦水含量測定檢測腦損傷程度。采用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白(Atg5、Beclinl和LC3)和炎癥因子(IL-1p)的表達(dá)；采用免疫組織化學(xué)檢測炎癥細(xì)胞的表達(dá)量,并觀察自噬相關(guān)蛋白是否在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。 2.成年雄性SD大鼠側(cè)腦室注射分別給予自噬的抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和自噬的激活劑雷帕霉素(RAP),成年雄性SD大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)+溶劑組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+雷帕霉素預(yù)處理組和蛛網(wǎng)膜下腔出血+3-MA預(yù)處理組,通過神經(jīng)功能缺陷評分,腦水含量測定檢測早期腦損傷程度。采用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白(Atg5、Beclinl和LC3)、炎癥因子(IL-1p)和NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白(NLRP3、ASC和Caspasel)的表達(dá)。 第二部分 1.成年雄性SD大鼠腹腔注射褪黑素(150mg/kg),成年雄性SD大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)+溶劑組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組和蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素治療組,通過神經(jīng)功能缺陷評分,不同部位腦組織的腦水含量測定檢測早期腦損傷程度。 2.(1)成年雄性SD大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)+溶劑組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組和蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素治療組,測量腦組織Evans blue含量,免疫組織化學(xué)檢測腦組織IgG染色,采用Western blot檢測緊密連接相關(guān)蛋白(ZO-1、occludin和claudin5)、炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白(MMP9和VEGF)和炎癥因子(IL-1β、IL-6和TNF-a)的表達(dá),明膠酶譜法檢測炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白(MMP9和MMP2)的活性。 (2)成年雄性SD大鼠側(cè)腦室注射自噬抑制劑3-MA,腹腔注射褪黑素,成年雄性SD大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)+溶劑組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素治療組和蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素治療組+3-MA預(yù)處理組,采用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白(Atg5、Beclin1和LC3)、炎癥因子(IL-1β)和NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白(NLRP3、ASC和caspase1)的表達(dá)。 3.(1)成年雄性SD大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)+溶劑組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組和蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素治療組,通過TUNEL法測定細(xì)胞凋亡程度,免疫組織化學(xué)檢測凋亡相關(guān)蛋白(Caspase3)的表達(dá)程度。 (2)成年雄性SD大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)+溶劑組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組、蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素治療組和蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素治療組+3-MA預(yù)處理組,Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白(LC3)、凋亡相關(guān)蛋白(胞漿Bax、胞漿Cytochrome c、線粒體Bax、線粒體Cytochrome c和Caspase3)的表達(dá)。 結(jié)果 第一部分 1.蛛網(wǎng)膜下腔出血后72h內(nèi)大鼠的腦水含量上升程度和神經(jīng)功能評分下降程度在24h時達(dá)到高峰,western blot結(jié)果顯示蛛網(wǎng)膜下腔出血后72h內(nèi)LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ比率上升,Atg5、Beclinl和IL-1p的水平上升,在24小時達(dá)到高峰。免疫組織化學(xué)結(jié)果提示,蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h,腦組織ED1陽性標(biāo)記的炎癥細(xì)胞數(shù)量增加,LC3和小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物離子鈣接頭分子(Ionized calcium bindingadaptor molecule1, Ibal)共熒光定位,提示LC3在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。 2.蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h,Western blot結(jié)果顯示3-MA預(yù)處理降低了LC-3Ⅱ/LC3-I比率,下調(diào)了Atg5和Beclinl的水平,IL-1β、NLRP3、ASC和Caspase1的水平上升,并且加劇了腦水含量的上升和神經(jīng)功能缺陷；Western blot結(jié)果顯示RAP預(yù)處理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率上升,Atg5和Beclinl的水平升高,減少了IL-1β、 NLRP3和Caspase1水平的上升,并且緩解了腦水含量的上升和神經(jīng)功能缺陷。 第二部分 1.蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h,褪黑素治療緩解了左右腦半球腦水含量的上升和神經(jīng)功能缺陷。 2.(1)蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h,褪黑素治療緩解了Evans blue染料和IgG的漏出,Western blot結(jié)果顯示,褪黑素治療緩解了ZO-1、occludin和claudin5水平的下降,減輕了MMP9、VEGF、IL-1β、IL-6和TNF-α水平的上升,下調(diào)了MMP9的活性上升。 (2)蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h, Western blot結(jié)果顯示褪黑素治療進(jìn)一步升高了LC-Ⅱ/LC-Ⅰ的比率,增加了Atg5和Beclin1的水平,下調(diào)了IL-1β、NLRP3和Caspase1的水平；3-MA預(yù)處理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率下降,Atg5和Beclinl的水平下降,IL-1β、NLRP3和Caspase1的水平上升。 3.(1)蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h, TUNEL的結(jié)果顯示褪黑素治療緩解了細(xì)胞凋亡的上升,減輕了Caspase3表達(dá)的增加。 (2)蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h, Western blot的結(jié)果顯示褪黑素治療進(jìn)一步升高了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率,減輕了Caspase3、細(xì)胞胞漿Cytochrome c和線粒體Bax水平的上升；3-MA預(yù)處理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率下降,Caspase3、細(xì)胞胞漿Cytochrome c和線粒體Bax的水平上升。 結(jié)論 第一部分 1.蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中,腦水腫、炎癥因子IL-1β和自噬激活水平均在24h達(dá)到高峰。結(jié)合蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h炎癥相關(guān)細(xì)胞的激活水平和自噬相關(guān)蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá),提示自噬的激活可能在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的炎癥反應(yīng)中起重要作用。 2.自噬的誘導(dǎo)劑RAP提高了自噬水平,降低了炎癥因子IL-1β的水平,減輕了蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷；相反的,自噬抑制劑3-MA降低了自噬水平,升高了炎癥因子IL-1p的水平,加重了蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷。自噬對炎癥因子IL-1β的這一作用可能與其調(diào)控NLRP3炎癥小體影響其激活Caspase1有關(guān)。 第二部分 1.褪黑素在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后減輕了雙側(cè)大腦半球腦組織水腫,并改善其神經(jīng)功能。 2.褪黑素治療在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中降低了IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的水平,調(diào)節(jié)了VEGF和MMP9的蛋白水平,抑制了MMP9的活性,進(jìn)而減輕血腦屏障中緊密連接的破壞,維持了血腦屏障的完整性。褪黑素調(diào)節(jié)IL-1β水平的機(jī)制可能是由于上調(diào)了蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的自噬水平,降低了炎癥小體NLRP3相關(guān)蛋白NLRP3的蛋白水平,進(jìn)而影響了下游炎癥因子IL-1β的水平,最終對蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生了調(diào)節(jié)作用。 3.褪黑素治療在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中抑制了神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞凋亡。褪黑素這一作用的機(jī)制可能與其在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中能夠進(jìn)一步上調(diào)自噬水平,抑制了Bax向線粒體的聚集,從而緩解了細(xì)胞色素C向細(xì)胞胞漿中的釋放,最終下調(diào)了凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3的蛋白水平有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.35

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2295136