【摘要】：成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factors,FGFs)超家族在人和小鼠中共包括22個(gè)基因。FGFs通過其受體FGFRs發(fā)揮著包括早期胚胎和器官發(fā)育等在內(nèi)的眾多生命進(jìn)程。FGF2又稱基礎(chǔ)FGF,是FGF超家族成員之一。研究顯示FGF2在血管形成和損傷修復(fù)中作為一個(gè)增生因子而存在,同時(shí)越來越多的研究表明FGF2能夠作為一個(gè)促癌蛋白從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在人的黑色素瘤中FGF2和FGFR1呈現(xiàn)顯著高表達(dá),并且在黑色素瘤細(xì)胞體外成瘤試驗(yàn)中,抑制FGF2或者FGFR1的表達(dá)能夠顯著抑制腫瘤的生長。FGF2-FGFR1信號(hào)通路的高表達(dá)也是小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)瘤等的重要發(fā)病誘因。先前的研究表明在超過94%的膠質(zhì)瘤患者中FGF2 m RNA水平的表達(dá)顯著上調(diào)并且高表達(dá)的FGF2能夠增加膠質(zhì)瘤的惡性程度。另外研究提示FGF2具有抗凋亡的特性能夠通過上調(diào)一些抗凋亡的基因,例如BCL-2和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-xl基因(B-cell lymphoma/Leukemia-xl,BCL-XL)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥性。在人體中,FGF2有五個(gè)亞型(18,22,22.5,24 and 34 k Da),分別由FGF2的m RNA選擇性翻譯而產(chǎn)生。分子量大小為18KDa的FGF2(18K-FGF2)是從經(jīng)典的Kozak AUG密碼子開始翻譯的,它包含了155個(gè)氨基酸并且是FGF2的核心區(qū)域。剩余的四個(gè)亞型被稱作高分子量的FGF2(HMW-FGF2),它們是選擇性由CUG密碼子轉(zhuǎn)錄翻譯的。之前的研究顯示,HMW-FGF2主要定位在核內(nèi),而18K-FGF2則定位在胞漿,并且核內(nèi)的HMW-FGF2與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)。然而,有關(guān)不同亞型的FGF2在細(xì)胞中分布不同的機(jī)制仍然不甚明了。在我們的研究中,我們不僅探討了HMW-FGF2入核的機(jī)制而且證實(shí)了核內(nèi)的HMW-FGF2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G的增殖和存活具有重要影響。HMW-FGF2的入核與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白karyopherin家族成員Kapβ2密切相關(guān)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)HMW-FGF2的入核還與調(diào)控Kapβ2-入核復(fù)合物的Ran GTPase密切相關(guān),與18K-FGF2過表達(dá)組相比,HMW-FGF2過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G的增殖能力�？傮w說來,我們的研究首次發(fā)現(xiàn)Kapβ2和Ran GTPase調(diào)控HWM-FGF2入核的分子機(jī)制,并揭示出了該分子機(jī)制在膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖中發(fā)揮的重要作用。第一部分18k-FGF2和HMW-FGF2的核定位檢測目的:為了探究18k-FGF2和HMW-FGF2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的定位,我們構(gòu)建了18K-FGF2和HMW-FGF2的過表達(dá)質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G中以探究FGF2在膠質(zhì)瘤中的定位。方法:質(zhì)粒構(gòu)建:將FGF2的c DNA序列(NCBI編號(hào):2247)作為PCR反應(yīng)的目的模板,使用以下引物擴(kuò)增HMW-FGF2:正向引物:5’-CCC AGA TCT ATG TAC CCA TAT GAT GTT CCA GAT TAC GCT CTG GGG GAC CGC GGG CGC GGC CGC-3’反向引物:5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’使用如下引物擴(kuò)增18K-FGF2:正向引物:5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’反向引物:5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’應(yīng)用Bgl II和Xba I進(jìn)行酶切并將上述擴(kuò)增的目的片段克隆到p CMV2載體中。得到的N端HA修飾的HMW-FGF2的氨基酸序列如下:YPYDVPDYA-LGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTA APRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPK RLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVC ANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYV ALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS得到的N端修飾的18K-FGF2的氨基酸序列如下:YPYDVPDYA-MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGG FFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMK EDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQY KLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS細(xì)胞培養(yǎng):人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G購自美國ATCC。細(xì)胞使用含10%胎牛血清MEM-α培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中無FGF2和EGF的添加。免疫熒光:將T98G細(xì)胞接種在玻片上然后轉(zhuǎn)染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后,用4%的多聚甲醛固定45min后終止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后細(xì)胞用激光共聚焦進(jìn)行檢測。核漿分離:將T98G細(xì)胞用p H為7.4包含5m M磷酸鈉、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m MKCl、2m M二硫蘇糖醇、1m M Mg Cl2、0.5m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黃皂苷的裂解液裂解,同時(shí)將裂解產(chǎn)物刮取下來。加入包含30%蔗糖的核提取緩沖液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min離心10min。細(xì)胞漿存在于上清液中,而下層為細(xì)胞核提取物。蛋白免疫印跡:將細(xì)胞用PBS清洗并用添加蛋白抑制劑的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100和2m M PMSF)進(jìn)行裂解。蛋白濃度用BCA法進(jìn)行測量和定量。使用25μg總蛋白進(jìn)行蛋白電泳。結(jié)果:我們成功的構(gòu)建了18K-FGF2和HMW-FGF2 HA修飾的過表達(dá)質(zhì)粒,并通過測序和蛋白免疫印跡檢驗(yàn)成功。使用HA抗體進(jìn)行免疫熒光結(jié)果顯示HMW-FGF2主要定位于細(xì)胞核中,而18K-FGF2則定位在胞漿中。盡管HWM-FGF2有三個(gè)區(qū)別較為明顯的亞型(22,24,34k Da),然而結(jié)果只顯示了一種條帶較為清楚的FGF2,這是由于N端修飾的HA標(biāo)簽阻遏了從CTGs起始的HMW-FGF2的翻譯。這種的特殊的表達(dá)方式消除了實(shí)驗(yàn)誤差以及提供了較好的實(shí)驗(yàn)條件。通過蛋白免疫印跡分析分別轉(zhuǎn)染HWM或18K-FGF2的細(xì)胞核漿分離產(chǎn)生的蛋白,結(jié)果顯示幾乎所有過表的18K-FGF2都定位在細(xì)胞漿中,而HMW-FGF2主要定位在細(xì)胞核中,只有少量存在細(xì)胞漿中。結(jié)論:1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HMW-FGF2主要定位在細(xì)胞核中。2 18K-FGF2主要定位在細(xì)胞漿中。第二部分kapβ2介導(dǎo)的FGF2入核機(jī)制目的:包含核定位序列(NLSs)的蛋白的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)往往受到Kapβ的調(diào)控,為了探究Kapβ是否參與了包含NLSs序列的HMW-FGF2的入核,我們將HA-HMW,HA-18K和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)T98G細(xì)胞中并使用蛋白免疫共沉淀分析Kapβ2和FGF2的結(jié)合關(guān)系。為了探究Kapβ2是HMW-FGF2的核定位所必須的,我們使用了兩種不同的Kapβ2 m RNA干擾序列進(jìn)行沉默Kapβ2的表達(dá),并使用蛋白免疫共沉淀法進(jìn)行檢驗(yàn);同時(shí)使用核漿分離檢測干擾Kapβ2后對(duì)FGF2在胞漿和核中的定位。由于FGF2信號(hào)通路調(diào)控了包括細(xì)胞增殖在內(nèi)的多個(gè)生物學(xué)功能,接著我們探究了FGF2與Kapβ2是否對(duì)T98G增殖有影響。方法:RNA干擾:Kapβ2RNA干擾核苷酸由Dharmacon公司合成。將T98G細(xì)胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中并用Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)檢測。定量PCR檢測:使用Trizol(Invitrogen,USA)提取RNA,并使用Promega.SYBR green試劑盒(Thermo Scientific,USA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測�；虻谋磉_(dá)量用以2-ΔΔCt法進(jìn)行分析并用GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。蛋白免疫共沉淀:轉(zhuǎn)染FGF2的細(xì)胞用PBS清洗幾遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100以及2m M PMSF)。將裂解的蛋白用BCA試劑盒進(jìn)行定量。按照抗體說明書使用HA抗體結(jié)合目的蛋白并在4℃過夜。使用A/G凝膠將HA抗體復(fù)合物洗脫下來并離心,在95℃加熱變性。將制備的蛋白樣品用蛋白免疫印跡進(jìn)行檢測。免疫熒光:將T98G細(xì)胞接種在玻片上然后轉(zhuǎn)染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后用4%的多聚甲醛固定45min后終止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后細(xì)胞用激光共聚焦進(jìn)行檢測。核漿分離:將T98G細(xì)胞用p H為7.4包含5m M磷酸鈉、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m M KCl、2m M二硫蘇糖醇、1m M Mg Cl2、0.5m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黃皂苷的裂解液裂解,同時(shí)將裂解產(chǎn)物刮取下來,加入包含30%蔗糖的核提取緩沖液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min離心10min。細(xì)胞漿存在于上清液中,而下層為細(xì)胞核提取物。MTT分析:為了檢測細(xì)胞增殖,按照說明書使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Roche,Switzerland)進(jìn)行檢測。將T98G細(xì)胞用0.5mg/ml MTT處理并在含5%O2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),接著使用裂解緩沖液孵育過夜,并在570nm吸收光下進(jìn)行檢測。統(tǒng)計(jì)分析:所有結(jié)果取自至少五次獨(dú)立結(jié)果,并使用mean±SEM標(biāo)準(zhǔn)化后展示。處理組與對(duì)照組的差異使用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,當(dāng)p0.05時(shí)表示具有明顯差異。結(jié)果:使用Kapβ2干擾能夠?qū)崿F(xiàn)80%左右的干擾效率并且能夠顯著抑制Kapβ2的m RNA水平和蛋白水平。使用免疫熒光染色顯示干擾Kapβ2等能夠抑制核漿轉(zhuǎn)運(yùn),并且導(dǎo)致HMW-FGF2的亞細(xì)胞分布。對(duì)免疫熒光進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,HMW-FGF2轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組相比,核與漿中FGF2的比值為85%和15%,而干擾Kapβ2后則與對(duì)照組相比無顯著差異,比值分別為50%和49%。核漿分離結(jié)果與蛋白免疫熒光結(jié)果類似,Kapβ2干擾后HMW-FGF2在核內(nèi)的表達(dá)水平顯著下降。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示盡管HWM-FGF2和18K-FGF2過表達(dá)都能促進(jìn)細(xì)胞增殖,然而HWM-FGF2過表達(dá)促進(jìn)增殖效果更為明顯。HWM-FGF2組在Kapβ2干擾后能夠顯著抑制其增殖能力,而18K-FGF2過表達(dá)組則沒有明顯變化。結(jié)論:1 HMW-FGF2的入核依賴于Kapβ2。2 HMW-FGF2能夠通過Kapβ2入核促進(jìn)T98G增殖。第三部分FGF2入核依賴于Ran GTPase目的:研究顯示Kapβ2搬運(yùn)復(fù)合物的核漿轉(zhuǎn)運(yùn)活性依賴于Ran GTPase核苷酸循環(huán)。為了確認(rèn)Ran GTPase在Kapβ2-HMW-FGF2核轉(zhuǎn)運(yùn)的重要性,我們使用了GTPγS和GDPβS處理細(xì)胞。GTPγS是無水解酶活性的GTP的類似物,可以使Ran保持在GTP的結(jié)合位置。GDPβS也是一種無水解酶活性的GDP的類似物,并能使Ran保持在與GDP結(jié)合的位置。為了探究Ran GTPase對(duì)Kapβ2-HMW-FGF2促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,我們使用GTPγS和GDPβS處理細(xì)胞,從而探究Ran GTPase對(duì)T98G細(xì)胞增殖的影響。方法:GDPβS和GTPγS處理:使用HA-HMW-FGF2轉(zhuǎn)染T98G細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后將培養(yǎng)基換成含0.1n M GTPγS、GDPβs或者無菌水作為對(duì)照。將細(xì)胞放置在37℃進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞提取、核漿分離以及MTT分析。免疫熒光:將T98G細(xì)胞接種在玻片上然后轉(zhuǎn)染HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后,用4%的多聚甲醛固定45min后終止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后,用二抗孵育60min。染色后細(xì)胞用激光共聚焦進(jìn)行檢測。核漿分離:將T98G細(xì)胞用p H為7.4,包含5m M磷酸鈉、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m M KCl、2m M二硫蘇糖醇、1m M Mg Cl2、0.5m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黃皂苷的裂解液裂解,同時(shí)將裂解產(chǎn)物刮取下來。加入包含30%蔗糖的核提取緩沖液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min離心10min。細(xì)胞漿存在于上清液中,而下層為細(xì)胞核提取物。蛋白免疫共沉淀:轉(zhuǎn)染FGF2的細(xì)胞用PBS清洗幾遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100以及2m M PMSF)。將裂解的蛋白用BCA試劑盒進(jìn)行定量。按照抗體說明書使用HA抗體結(jié)合目的蛋白并在4℃過夜。使用A/G凝膠將HA抗體復(fù)合物洗脫下來,離心后95℃加熱變性,制備完成上樣樣品。將制備的蛋白樣品用蛋白免疫印跡進(jìn)行檢測。MTT分析:為了檢測T98G細(xì)胞增殖,按照說明書使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Roche,Switzerland)進(jìn)行檢測。將T98G細(xì)胞用0.5 mg/ml MTT處理并在含5%O2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),接著使用裂解緩沖液孵育過夜,并在570nm吸收光下進(jìn)行檢測。統(tǒng)計(jì)分析:所有結(jié)果取自至少五次獨(dú)立結(jié)果,并使用mean±SEM標(biāo)準(zhǔn)化后展示。處理組與對(duì)照組的差異使用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,當(dāng)p0.05時(shí)表示具有明顯差異。結(jié)果:使用HA進(jìn)行免疫熒光結(jié)果顯示GTPγS和GDPβS處理后都能夠顯著阻斷HMW-FGF2過表達(dá)的T98G細(xì)胞中的HMW-FGF2的核聚集。使用蛋白免疫印跡分析核漿分離結(jié)果顯示,HMW-FGF2過表達(dá)的T98G細(xì)胞中抑制Ran GTPase活性也能夠阻斷HMW-FGF2的核轉(zhuǎn)錄。蛋白免疫共沉淀結(jié)果顯示只有GDPβS處理后能夠使HMW-FGF2與Ran結(jié)合。細(xì)胞增殖結(jié)果與干擾Kapβ2結(jié)果類似;使用GTPγS和GDPβS抑制Ran GTPase的活性以及FGF2核轉(zhuǎn)錄后,能夠顯著降低HMW-FGF2導(dǎo)致的T98G細(xì)胞的過度增殖。結(jié)論:1 HMW-FGF2入核依賴于Ran GTPase。2 Ran GDP與FGF2結(jié)合調(diào)控FGF2的漿-核轉(zhuǎn)運(yùn)。第四部分FGF2入核激活A(yù)kt信號(hào)通路目的:為了探討FGF2對(duì)細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的機(jī)制,我們探究了細(xì)胞內(nèi)主要的調(diào)控通路PI3K/AKT信號(hào)通路的變化。為了探究是HMW-FGF2入核而不是18K-FGF2對(duì)FGF2促進(jìn)PI3K/AKT信號(hào)的作用,我們構(gòu)建了包含NLSs序列的18K-FGF2質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞從而探究其功能。方法:免疫熒光:將T98G細(xì)胞接種在玻片上然后轉(zhuǎn)染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后用4%的多聚甲醛固定45min后終止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后細(xì)胞用激光共聚焦進(jìn)行檢測。核漿分離:將T98G細(xì)胞用p H為7.4包含5m M磷酸鈉、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m MKCl、2m M二硫蘇糖醇、1m M Mg Cl2、0.5 m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黃皂苷的裂解液裂解,同時(shí)將裂解產(chǎn)物刮取下來。加入包含30%蔗糖的核提取緩沖液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min離心10min。細(xì)胞漿存在于上清液中,而下層為細(xì)胞核提取物。蛋白免疫共沉淀:轉(zhuǎn)染FGF2的細(xì)胞用PBS清洗幾遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100以及2m M PMSF)。將裂解的蛋白用BCA試劑盒進(jìn)行定量。按照抗體說明書使用HA抗體結(jié)合目的蛋白并在4℃過夜。使用A/G凝膠將HA抗體復(fù)合物洗脫下來,離心后95℃加熱變性,制備完成蛋白樣品。將制備的蛋白樣品用蛋白免疫印跡進(jìn)行檢測。MTT分析:為了檢測T98G細(xì)胞增殖,按照說明書使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Roche,Switzerland)進(jìn)行檢測。將T98G細(xì)胞用0.5mg/ml MTT處理并在含5%O2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),接著使用裂解緩沖液孵育過夜,并在570nm吸收光下進(jìn)行檢測。統(tǒng)計(jì)分析:所有結(jié)果取自至少五次獨(dú)立結(jié)果,并使用mean±SEM標(biāo)準(zhǔn)化后展示。處理組與對(duì)照組的差異使用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,當(dāng)p0.05時(shí)表示具有明顯差異。結(jié)果:過表達(dá)18K-FGF2和HMW-FGF2都能夠下調(diào)PTEN的表達(dá),但是HMW-FGF2下調(diào)效果更為明顯。過表達(dá)FGF2后能夠上調(diào)p-Akt表達(dá)水平,這顯示FGF2可能是通過下游的PTEN/p-Akt信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,同時(shí)在HMW-FGF2過表達(dá)的T98G細(xì)胞中干擾Kapβ2能夠抑制p-Akt表達(dá)水平。而18K-FGF2添加NLS序列修飾后能夠促進(jìn)其進(jìn)行入核,并且細(xì)胞增殖顯示18K-NLS-FGF2過表達(dá)的T98G細(xì)胞增殖速率明顯高于其他FGF2過表達(dá)的細(xì)胞系,特別是HMW-FGF2。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示18K-NLS-FGF2過表達(dá)能夠顯著抑制PTEN表達(dá)并能夠提高p-Akt的表達(dá)。結(jié)論:1核內(nèi)的HMW-FGF2能夠活化p-Akt信號(hào)通路。2 NLS序列在HMW-FGF2入核中起了關(guān)鍵作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
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本文編號(hào)：2285522