【摘要】：成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factors,FGFs)超家族在人和小鼠中共包括22個基因。FGFs通過其受體FGFRs發(fā)揮著包括早期胚胎和器官發(fā)育等在內的眾多生命進程。FGF2又稱基礎FGF,是FGF超家族成員之一。研究顯示FGF2在血管形成和損傷修復中作為一個增生因子而存在,同時越來越多的研究表明FGF2能夠作為一個促癌蛋白從而調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在人的黑色素瘤中FGF2和FGFR1呈現(xiàn)顯著高表達,并且在黑色素瘤細胞體外成瘤試驗中,抑制FGF2或者FGFR1的表達能夠顯著抑制腫瘤的生長。FGF2-FGFR1信號通路的高表達也是小細胞肺癌和膠質瘤等的重要發(fā)病誘因。先前的研究表明在超過94%的膠質瘤患者中FGF2 m RNA水平的表達顯著上調并且高表達的FGF2能夠增加膠質瘤的惡性程度。另外研究提示FGF2具有抗凋亡的特性能夠通過上調一些抗凋亡的基因,例如BCL-2和B細胞淋巴瘤/白血病-xl基因(B-cell lymphoma/Leukemia-xl,BCL-XL)導致腫瘤細胞的耐藥性。在人體中,FGF2有五個亞型(18,22,22.5,24 and 34 k Da),分別由FGF2的m RNA選擇性翻譯而產生。分子量大小為18KDa的FGF2(18K-FGF2)是從經典的Kozak AUG密碼子開始翻譯的,它包含了155個氨基酸并且是FGF2的核心區(qū)域。剩余的四個亞型被稱作高分子量的FGF2(HMW-FGF2),它們是選擇性由CUG密碼子轉錄翻譯的。之前的研究顯示,HMW-FGF2主要定位在核內,而18K-FGF2則定位在胞漿,并且核內的HMW-FGF2與膠質瘤細胞的增殖能力密切相關。然而,有關不同亞型的FGF2在細胞中分布不同的機制仍然不甚明了。在我們的研究中,我們不僅探討了HMW-FGF2入核的機制而且證實了核內的HMW-FGF2對膠質瘤細胞系T98G的增殖和存活具有重要影響。HMW-FGF2的入核與核轉運蛋白karyopherin家族成員Kapβ2密切相關。同時我們發(fā)現(xiàn)HMW-FGF2的入核還與調控Kapβ2-入核復合物的Ran GTPase密切相關,與18K-FGF2過表達組相比,HMW-FGF2過表達能夠顯著促進膠質瘤細胞系T98G的增殖能力。總體說來,我們的研究首次發(fā)現(xiàn)Kapβ2和Ran GTPase調控HWM-FGF2入核的分子機制,并揭示出了該分子機制在膠質瘤的細胞增殖中發(fā)揮的重要作用。第一部分18k-FGF2和HMW-FGF2的核定位檢測目的:為了探究18k-FGF2和HMW-FGF2在膠質瘤細胞系中的定位,我們構建了18K-FGF2和HMW-FGF2的過表達質粒,并將其轉染至膠質瘤細胞系T98G中以探究FGF2在膠質瘤中的定位。方法:質粒構建:將FGF2的c DNA序列(NCBI編號:2247)作為PCR反應的目的模板,使用以下引物擴增HMW-FGF2:正向引物:5’-CCC AGA TCT ATG TAC CCA TAT GAT GTT CCA GAT TAC GCT CTG GGG GAC CGC GGG CGC GGC CGC-3’反向引物:5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’使用如下引物擴增18K-FGF2:正向引物:5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’反向引物:5’-CCC TCT AGA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG AAG-3’應用Bgl II和Xba I進行酶切并將上述擴增的目的片段克隆到p CMV2載體中。得到的N端HA修飾的HMW-FGF2的氨基酸序列如下:YPYDVPDYA-LGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTA APRAAPAARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPK RLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVC ANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYV ALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS得到的N端修飾的18K-FGF2的氨基酸序列如下:YPYDVPDYA-MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGG FFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMK EDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQY KLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS細胞培養(yǎng):人膠質瘤細胞系T98G購自美國ATCC。細胞使用含10%胎牛血清MEM-α培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中無FGF2和EGF的添加。免疫熒光:將T98G細胞接種在玻片上然后轉染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后,用4%的多聚甲醛固定45min后終止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后細胞用激光共聚焦進行檢測。核漿分離:將T98G細胞用p H為7.4包含5m M磷酸鈉、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m MKCl、2m M二硫蘇糖醇、1m M Mg Cl2、0.5m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黃皂苷的裂解液裂解,同時將裂解產物刮取下來。加入包含30%蔗糖的核提取緩沖液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min離心10min。細胞漿存在于上清液中,而下層為細胞核提取物。蛋白免疫印跡:將細胞用PBS清洗并用添加蛋白抑制劑的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100和2m M PMSF)進行裂解。蛋白濃度用BCA法進行測量和定量。使用25μg總蛋白進行蛋白電泳。結果:我們成功的構建了18K-FGF2和HMW-FGF2 HA修飾的過表達質粒,并通過測序和蛋白免疫印跡檢驗成功。使用HA抗體進行免疫熒光結果顯示HMW-FGF2主要定位于細胞核中,而18K-FGF2則定位在胞漿中。盡管HWM-FGF2有三個區(qū)別較為明顯的亞型(22,24,34k Da),然而結果只顯示了一種條帶較為清楚的FGF2,這是由于N端修飾的HA標簽阻遏了從CTGs起始的HMW-FGF2的翻譯。這種的特殊的表達方式消除了實驗誤差以及提供了較好的實驗條件。通過蛋白免疫印跡分析分別轉染HWM或18K-FGF2的細胞核漿分離產生的蛋白,結果顯示幾乎所有過表的18K-FGF2都定位在細胞漿中,而HMW-FGF2主要定位在細胞核中,只有少量存在細胞漿中。結論:1在膠質瘤細胞中HMW-FGF2主要定位在細胞核中。2 18K-FGF2主要定位在細胞漿中。第二部分kapβ2介導的FGF2入核機制目的:包含核定位序列(NLSs)的蛋白的核漿轉運往往受到Kapβ的調控,為了探究Kapβ是否參與了包含NLSs序列的HMW-FGF2的入核,我們將HA-HMW,HA-18K和空載質粒轉染進T98G細胞中并使用蛋白免疫共沉淀分析Kapβ2和FGF2的結合關系。為了探究Kapβ2是HMW-FGF2的核定位所必須的,我們使用了兩種不同的Kapβ2 m RNA干擾序列進行沉默Kapβ2的表達,并使用蛋白免疫共沉淀法進行檢驗;同時使用核漿分離檢測干擾Kapβ2后對FGF2在胞漿和核中的定位。由于FGF2信號通路調控了包括細胞增殖在內的多個生物學功能,接著我們探究了FGF2與Kapβ2是否對T98G增殖有影響。方法:RNA干擾:Kapβ2RNA干擾核苷酸由Dharmacon公司合成。將T98G細胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中并用Lipofectamine 2000(Invitrogen,USA)進行脂質體轉染,轉染48小時后進行后續(xù)檢測。定量PCR檢測:使用Trizol(Invitrogen,USA)提取RNA,并使用Promega.SYBR green試劑盒(Thermo Scientific,USA)進行逆轉錄并進行實時定量PCR檢測�；虻谋磉_量用以2-ΔΔCt法進行分析并用GAPDH進行標準化。蛋白免疫共沉淀:轉染FGF2的細胞用PBS清洗幾遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100以及2m M PMSF)。將裂解的蛋白用BCA試劑盒進行定量。按照抗體說明書使用HA抗體結合目的蛋白并在4℃過夜。使用A/G凝膠將HA抗體復合物洗脫下來并離心,在95℃加熱變性。將制備的蛋白樣品用蛋白免疫印跡進行檢測。免疫熒光:將T98G細胞接種在玻片上然后轉染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后用4%的多聚甲醛固定45min后終止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后細胞用激光共聚焦進行檢測。核漿分離:將T98G細胞用p H為7.4包含5m M磷酸鈉、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m M KCl、2m M二硫蘇糖醇、1m M Mg Cl2、0.5m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黃皂苷的裂解液裂解,同時將裂解產物刮取下來,加入包含30%蔗糖的核提取緩沖液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min離心10min。細胞漿存在于上清液中,而下層為細胞核提取物。MTT分析:為了檢測細胞增殖,按照說明書使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Roche,Switzerland)進行檢測。將T98G細胞用0.5mg/ml MTT處理并在含5%O2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),接著使用裂解緩沖液孵育過夜,并在570nm吸收光下進行檢測。統(tǒng)計分析:所有結果取自至少五次獨立結果,并使用mean±SEM標準化后展示。處理組與對照組的差異使用t檢驗進行分析,當p0.05時表示具有明顯差異。結果:使用Kapβ2干擾能夠實現(xiàn)80%左右的干擾效率并且能夠顯著抑制Kapβ2的m RNA水平和蛋白水平。使用免疫熒光染色顯示干擾Kapβ2等能夠抑制核漿轉運,并且導致HMW-FGF2的亞細胞分布。對免疫熒光進行統(tǒng)計分析結果顯示,HMW-FGF2轉染組和對照組相比,核與漿中FGF2的比值為85%和15%,而干擾Kapβ2后則與對照組相比無顯著差異,比值分別為50%和49%。核漿分離結果與蛋白免疫熒光結果類似,Kapβ2干擾后HMW-FGF2在核內的表達水平顯著下降。細胞增殖實驗顯示盡管HWM-FGF2和18K-FGF2過表達都能促進細胞增殖,然而HWM-FGF2過表達促進增殖效果更為明顯。HWM-FGF2組在Kapβ2干擾后能夠顯著抑制其增殖能力,而18K-FGF2過表達組則沒有明顯變化。結論:1 HMW-FGF2的入核依賴于Kapβ2。2 HMW-FGF2能夠通過Kapβ2入核促進T98G增殖。第三部分FGF2入核依賴于Ran GTPase目的:研究顯示Kapβ2搬運復合物的核漿轉運活性依賴于Ran GTPase核苷酸循環(huán)。為了確認Ran GTPase在Kapβ2-HMW-FGF2核轉運的重要性,我們使用了GTPγS和GDPβS處理細胞。GTPγS是無水解酶活性的GTP的類似物,可以使Ran保持在GTP的結合位置。GDPβS也是一種無水解酶活性的GDP的類似物,并能使Ran保持在與GDP結合的位置。為了探究Ran GTPase對Kapβ2-HMW-FGF2促進細胞增殖的作用,我們使用GTPγS和GDPβS處理細胞,從而探究Ran GTPase對T98G細胞增殖的影響。方法:GDPβS和GTPγS處理:使用HA-HMW-FGF2轉染T98G細胞,在轉染后將培養(yǎng)基換成含0.1n M GTPγS、GDPβs或者無菌水作為對照。將細胞放置在37℃進行培養(yǎng)并進行后續(xù)細胞提取、核漿分離以及MTT分析。免疫熒光:將T98G細胞接種在玻片上然后轉染HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后,用4%的多聚甲醛固定45min后終止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后,用二抗孵育60min。染色后細胞用激光共聚焦進行檢測。核漿分離:將T98G細胞用p H為7.4,包含5m M磷酸鈉、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m M KCl、2m M二硫蘇糖醇、1m M Mg Cl2、0.5m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黃皂苷的裂解液裂解,同時將裂解產物刮取下來。加入包含30%蔗糖的核提取緩沖液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min離心10min。細胞漿存在于上清液中,而下層為細胞核提取物。蛋白免疫共沉淀:轉染FGF2的細胞用PBS清洗幾遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100以及2m M PMSF)。將裂解的蛋白用BCA試劑盒進行定量。按照抗體說明書使用HA抗體結合目的蛋白并在4℃過夜。使用A/G凝膠將HA抗體復合物洗脫下來,離心后95℃加熱變性,制備完成上樣樣品。將制備的蛋白樣品用蛋白免疫印跡進行檢測。MTT分析:為了檢測T98G細胞增殖,按照說明書使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Roche,Switzerland)進行檢測。將T98G細胞用0.5 mg/ml MTT處理并在含5%O2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),接著使用裂解緩沖液孵育過夜,并在570nm吸收光下進行檢測。統(tǒng)計分析:所有結果取自至少五次獨立結果,并使用mean±SEM標準化后展示。處理組與對照組的差異使用t檢驗進行分析,當p0.05時表示具有明顯差異。結果:使用HA進行免疫熒光結果顯示GTPγS和GDPβS處理后都能夠顯著阻斷HMW-FGF2過表達的T98G細胞中的HMW-FGF2的核聚集。使用蛋白免疫印跡分析核漿分離結果顯示,HMW-FGF2過表達的T98G細胞中抑制Ran GTPase活性也能夠阻斷HMW-FGF2的核轉錄。蛋白免疫共沉淀結果顯示只有GDPβS處理后能夠使HMW-FGF2與Ran結合。細胞增殖結果與干擾Kapβ2結果類似;使用GTPγS和GDPβS抑制Ran GTPase的活性以及FGF2核轉錄后,能夠顯著降低HMW-FGF2導致的T98G細胞的過度增殖。結論:1 HMW-FGF2入核依賴于Ran GTPase。2 Ran GDP與FGF2結合調控FGF2的漿-核轉運。第四部分FGF2入核激活Akt信號通路目的:為了探討FGF2對細胞增殖促進作用的機制,我們探究了細胞內主要的調控通路PI3K/AKT信號通路的變化。為了探究是HMW-FGF2入核而不是18K-FGF2對FGF2促進PI3K/AKT信號的作用,我們構建了包含NLSs序列的18K-FGF2質粒并轉染入T98G細胞從而探究其功能。方法:免疫熒光:將T98G細胞接種在玻片上然后轉染18K-FGF2或者HMW-FGF2。24h后用PBS清洗后用4%的多聚甲醛固定45min后終止并通透90min。使用HA一抗孵育90min后用二抗孵育60min。染色后細胞用激光共聚焦進行檢測。核漿分離:將T98G細胞用p H為7.4包含5m M磷酸鈉、50m M Na Cl、150m M蔗糖、5m MKCl、2m M二硫蘇糖醇、1m M Mg Cl2、0.5 m M Ca Cl2、以及0.1%洋地黃皂苷的裂解液裂解,同時將裂解產物刮取下來。加入包含30%蔗糖的核提取緩沖液(2.5m M Tris-HCl,p H 7.4,10m M Na Cl),1000g/min離心10min。細胞漿存在于上清液中,而下層為細胞核提取物。蛋白免疫共沉淀:轉染FGF2的細胞用PBS清洗幾遍后加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液(20m M Tris-HCl,p H 7.6,150m M Na Cl,1%Triton X-100以及2m M PMSF)。將裂解的蛋白用BCA試劑盒進行定量。按照抗體說明書使用HA抗體結合目的蛋白并在4℃過夜。使用A/G凝膠將HA抗體復合物洗脫下來,離心后95℃加熱變性,制備完成蛋白樣品。將制備的蛋白樣品用蛋白免疫印跡進行檢測。MTT分析:為了檢測T98G細胞增殖,按照說明書使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Roche,Switzerland)進行檢測。將T98G細胞用0.5mg/ml MTT處理并在含5%O2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),接著使用裂解緩沖液孵育過夜,并在570nm吸收光下進行檢測。統(tǒng)計分析:所有結果取自至少五次獨立結果,并使用mean±SEM標準化后展示。處理組與對照組的差異使用t檢驗進行分析,當p0.05時表示具有明顯差異。結果:過表達18K-FGF2和HMW-FGF2都能夠下調PTEN的表達,但是HMW-FGF2下調效果更為明顯。過表達FGF2后能夠上調p-Akt表達水平,這顯示FGF2可能是通過下游的PTEN/p-Akt信號通路發(fā)揮促進細胞增殖的作用,同時在HMW-FGF2過表達的T98G細胞中干擾Kapβ2能夠抑制p-Akt表達水平。而18K-FGF2添加NLS序列修飾后能夠促進其進行入核,并且細胞增殖顯示18K-NLS-FGF2過表達的T98G細胞增殖速率明顯高于其他FGF2過表達的細胞系,特別是HMW-FGF2。蛋白免疫印跡結果顯示18K-NLS-FGF2過表達能夠顯著抑制PTEN表達并能夠提高p-Akt的表達。結論:1核內的HMW-FGF2能夠活化p-Akt信號通路。2 NLS序列在HMW-FGF2入核中起了關鍵作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
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本文編號：2285522