【摘要】：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)和誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)為基因修飾以及基因治療提供了一種新型的研究工具。將基因修正后的人類多潛能性干細(xì)胞細(xì)胞經(jīng)過自體移植,可實(shí)現(xiàn)某些遺傳疾病治療的目的。我室一直致力于杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)及血友病A的基因治療研究。作為基因治療的靶細(xì)胞,解決iPS細(xì)胞的來源是進(jìn)行后續(xù)研究得以順利開展的基礎(chǔ)。本研究第一章內(nèi)容擬將病人來源的尿液細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞,為后續(xù)DMD病人的自體化基因治療提供合適的細(xì)胞來源。第二章研究內(nèi)容擬利用我室之前建立的定點(diǎn)整合hFⅧ的人胚胎干細(xì)胞細(xì)胞株ET5作為研究對象,初步建立hESCs向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞(Definitive endoderm cells, DECs)分化的技術(shù)平臺,從而為后續(xù)血友病A的治療中肝細(xì)胞的來源提供一種解決思路。 第一章：DMD病人尿液細(xì)胞向iPSCs的誘導(dǎo)與初步鑒定。 目的：利用DMD病人尿液來源的細(xì)胞獲得病人特異性iPSCs。 方法：1.收集DMD基因50號外顯子缺失的DMD病人尿液,分離并培養(yǎng)尿液細(xì)胞中腎小管上皮細(xì)胞。2.利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct4,Sox2, c-Myc和Klf4四種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入尿液細(xì)胞,經(jīng)過20天左右的誘導(dǎo),獲得形態(tài)與hESCs細(xì)胞系高度相似的細(xì)胞克隆。3.對所得的細(xì)胞克隆進(jìn)行多潛能性干細(xì)胞的表面標(biāo)志物、堿性磷酸酶、細(xì)胞核型及體外隨機(jī)分化的鑒定。 結(jié)果：1.經(jīng)上述方法誘導(dǎo)可獲得尿液細(xì)胞來源的iPSCs樣細(xì)胞系,MLPA檢測誘導(dǎo)后iPSCs基因組DMD基因50號外顯子缺失；2.誘導(dǎo)iPSCs細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性,且干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)與hESCs一致；細(xì)胞染色體核型顯示無染色體水平的畸變；體外EB形成檢測誘導(dǎo)的iPSCs可分化出表達(dá)內(nèi)、中胚層特異標(biāo)志物的細(xì)胞。 結(jié)論：建立了DMD基因50號外顯子缺失的iPS細(xì)胞系。 第二章：hESCs向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。 目的：初步建立hESCs定向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)分化以及鑒定的技術(shù)平臺。 方法：1.聯(lián)合BMP4、Activin A、chir99021誘導(dǎo)ET5向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞分化；2.分化過程的第一天和第五天抽提分化細(xì)胞的RNA, RT-PCR檢測內(nèi)胚層標(biāo)志基因Sox17, FoxA2的表達(dá)情況；3.分化五天后流式分析DE細(xì)胞表面特異標(biāo)志物c-kit(CD117)、CXCR4(CD184)的表達(dá)。 結(jié)果：1.聯(lián)合高濃度Activin A、BMP4、chir99021對ET5誘導(dǎo)5天,分化第二天即可在ET5克隆中觀察到上皮樣細(xì)胞的出現(xiàn)。2.分別抽提分化過程當(dāng)中第一天和第五天的細(xì)胞的RNA, RT-PCR分析可檢測到Sox17, FoxA2的表達(dá)。3.誘導(dǎo)五天后,流式分析DE細(xì)胞表面共表達(dá)c-kit、CXCR4陽性率達(dá)到39.01%。 結(jié)論：初步建立hESCs向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞分化的方法。
[Abstract]:Embryonic stem cell (embryonic stem cells, ESCs) and inducible multipotent stem cell (induced pluripotent stem cells, iPSCs) provide a new tool for gene modification and gene therapy. After autologous transplantation of genetically modified human multipotent stem cells, some genetic diseases can be treated. We have been working on gene therapy for Duchenne muscular dystrophy (DMD) and hemophilia A (hemophilia A). As the target cells of gene therapy, the source of iPS cells is the basis for further research. In the first chapter of this study, urine cells from patients were induced into iPS cells, which could provide suitable cell sources for autologous gene therapy in patients with DMD. In the second chapter, using the human embryonic stem cell strain ET5 which was established in front of our room to integrate hF 鈪，

本文編號：2264099