【摘要】：[背景] 腦卒中,又稱腦中風(fēng)或腦血管意外,是由腦部血液循環(huán)障礙導(dǎo)致大腦功能缺失為特征的一組疾病,在全世界是第三大致死病因,而在我國已經(jīng)成為第一大致死病因。然而,目前針對(duì)單個(gè)或多個(gè)腦血管危險(xiǎn)因素誘發(fā)腦卒中的遺傳和分子“決定因素”知之甚少。同時(shí),腦卒中發(fā)展過程中皮層神經(jīng)細(xì)胞以多種形式死亡,包括壞死、凋亡和自噬,這一復(fù)雜的細(xì)胞死亡分子信號(hào)通路仍不清楚。綜合過去30年來的研究,腦卒中細(xì)胞死亡的主要分子機(jī)理包括：興奮性神經(jīng)毒性、鈣超載和氧/氮化應(yīng)激。缺血缺氧時(shí),谷氨酸過量聚集于突觸,激活突觸后谷氨酸受體包括NMDA和AMPA受體,特別是NMDA受體起著至關(guān)重要的作用,大量Ca2+通過NMDA受體通道流入細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致Ca2+超載,并激活一系列蛋白酶、酯酶和核酶的降解過程從而引發(fā)下游致命反應(yīng),包括活性氧的產(chǎn)生,活性氮的產(chǎn)生,離子體內(nèi)失衡,線粒體功能紊亂等,最終細(xì)胞因?yàn)榈蛲?DNA斷裂和染色質(zhì)凝結(jié))或壞死(腫脹、破裂和細(xì)胞溶解)或者兩者的共同作用而死亡。缺血性卒中目前唯一有效的治療是運(yùn)用組織纖溶酶原激活物(tPA)進(jìn)行溶栓治療。然而,由于tPA的治療存在嚴(yán)格的治療指征、有出血副作用和溶栓治療時(shí)問窗較窄(4.5小時(shí)),只有很少的患者能從中受益。因此,探討新的干預(yù)方法和治療手段保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞來對(duì)抗缺血性卒中腦損傷極其重要。死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)是一個(gè)編碼160KD蛋白的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的絲氨酸-蘇氨酸激酶,我們的前期結(jié)果顯示,DAPK1與NMDA受體NR2B羧基末端(NR2B-CT)介導(dǎo)NMDA受體興奮性毒性作用。此外DAPK1還通過其死亡結(jié)構(gòu)域(Death Domain, DD)與p53的DNA結(jié)合域(p53DNA binding motif, p53DM)直接耦合匯聚卒中多條細(xì)胞死亡通路。但是直接干預(yù)DAPK1死亡信號(hào)能否更安全有效地治療缺血性腦卒中仍需進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。本研究將在前期工作基礎(chǔ)上,以谷氨酸受體偶聯(lián)的特異性細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白DAPK1及其作用的信號(hào)分子NR2B, p53為切入點(diǎn),通過運(yùn)用分子遺傳手段或應(yīng)用外源性小分子多肽干預(yù)DAPK1死亡信號(hào),在細(xì)胞水平與動(dòng)物整體水平進(jìn)一步探討腦卒中治療的有效策略。 [目的] 本研究的目的是運(yùn)用分子遺傳手段選擇性敲除興奮性神經(jīng)元中NR2B-CT,干預(yù)DAPK1-NR2B死亡信號(hào),或應(yīng)用外源性小分子多肽Tat-p53DM阻斷DAPK1-p53死亡信號(hào),探討腦卒中治療的有效策略。 [方法] 為了驗(yàn)證NMDA受體亞單位NR2B-CT介導(dǎo)DAPK1死亡信號(hào)參與調(diào)控缺血性卒中腦損傷,我們首先將本實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建的條件誘導(dǎo)性敲除NMDA受體NR2B-CT的點(diǎn)突變小鼠與在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)Cre重組酶的Camk2a-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,雙雜后代通過他莫西芬(TAM)誘導(dǎo)獲得在興奮性神經(jīng)元中特異性敲除NR2B-CT的突變小鼠(012362×NR2B-CT).通過PCR和尼式染色鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型和腦組織結(jié)構(gòu)表型。然后通過免疫組織化學(xué)(IHC)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)驗(yàn)證突變小鼠NR2B-CT在興奮性神經(jīng)元中的敲除。隨后,通過體外實(shí)驗(yàn)OGD或氧化應(yīng)激后PI染色檢測(cè)突變小鼠皮層神經(jīng)元的凋亡情況。同時(shí)通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)檢測(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)術(shù)后皮層組織NR2B與DAPK1相互作用。TTC染色,核磁共振成像(MRI), Fluoro-Jade C (FJ)染色檢測(cè)缺血后腦梗塞體積及死亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。最后通過行為學(xué)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn),生存率統(tǒng)計(jì)檢測(cè)MCAO術(shù)后一個(gè)月內(nèi)小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)情況。通過高架十字迷宮(Elevated Plus Maze)、水迷宮(Morris Water Maze)、條件恐懼實(shí)驗(yàn)(Fear Conditioning)檢測(cè)成年突變小鼠焦慮情況,空間學(xué)習(xí)記憶及恐懼記憶能力。 同時(shí),基于前期離體細(xì)胞研究結(jié)果,為了探討更為安全有效的缺血性卒中治療方法,我們運(yùn)用在體小鼠MCAO缺血模型,通過合成小分子穿膜肽Tat-p53DM阻斷缺血腦區(qū)DAPK1-p53死亡信號(hào),利用Co-IP與Western blotting檢測(cè)術(shù)后不同劑量的Tat-p53DM以及不同治療時(shí)間窗對(duì)DAPK1-p53相互作用的抑制效果,并通過TTC染色和FJ染色檢測(cè)術(shù)后腦梗塞的體積和死亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。然后應(yīng)用修訂后的神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分系統(tǒng)(7分制),轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn),足誤實(shí)驗(yàn)(Foot Fault Test)檢測(cè)術(shù)后一個(gè)月內(nèi)小鼠經(jīng)多肽治療后神經(jīng)功能恢復(fù)情況和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。最后通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OpenField)、高架十字迷宮、水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠自主運(yùn)動(dòng)行為,探索行為,焦慮情況及空間學(xué)習(xí)記憶能力。 [結(jié)果] 我們發(fā)現(xiàn)在興奮性神經(jīng)元中特異性敲除NR2B-CT (012362×NR2B-CT)降低了MCAO術(shù)后皮層內(nèi)DAPK1與NR2B的結(jié)合。體外OGD實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示012362XNR2B-CT小鼠原代培養(yǎng)的神經(jīng)元PI染色陽性(PI+)細(xì)胞數(shù)目約為對(duì)照組的40%-50%,pMLC(反映DAPK1活性),cleaved caspase3表達(dá)水平約為對(duì)照組的70%,在應(yīng)用H202分別刺激1小時(shí),2小時(shí),3小時(shí)后,012362×NR2B-CT小鼠pI+分別為對(duì)照組的88%,40%,36%,說明體外模擬缺血時(shí),012362×NR2B-CT小鼠神經(jīng)元死亡比率明顯降低。與OGD及氧化應(yīng)激結(jié)果類似,在體模擬缺血的MCAO模型中012362×NR2B-CT小鼠成功干預(yù)了DAPK1與NR2B的結(jié)合,較野生型小鼠也顯示更少的神經(jīng)元死亡。TTC染色,MRI,FJ染色結(jié)果顯示012362×NR2B-CT小鼠腦梗塞體積和腦水腫體積明顯減小,皮層和紋狀體死亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著減少。而且在術(shù)后一個(gè)月,012362×NR2B-CT小鼠存活率較對(duì)照組顯著提高,在轉(zhuǎn)棒上的停留時(shí)間較對(duì)照組顯著增加。四周時(shí),012362XNR2B-CT突變小鼠肢體協(xié)調(diào)能力基本恢復(fù)到術(shù)前的90%。因此在興奮性神經(jīng)元中敲除的NR2B-CT干預(yù)了DAPK1-NR2B死亡信號(hào),可有效治療卒中。但是值得注意的是,Morris水迷宮結(jié)果顯示,在“定位航行試驗(yàn)”中,012362X NR2B-CT從第4天開始潛伏期顯著高于對(duì)照組,在“空間探索試驗(yàn)”中012362ＸNR2B-CT小鼠顯示更長的潛伏期和較少的穿越平臺(tái)次數(shù)。這一結(jié)果提示012362×NR2B-CT小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力降低。條件性恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在檢測(cè)場(chǎng)景恐懼記憶時(shí),012362×NR2B-CT小鼠僵直反應(yīng)次數(shù)也明顯降低,表明其海馬依賴的恐懼記憶能力降低。 以上結(jié)果提示通過分子遺傳手段敲除與DAPK1結(jié)合的NR2B羧基末端片段干預(yù)DAPK1-NR2B死亡信號(hào)治療缺血性卒中有一定的局限性,因此,基于近期研究工作,我們將目光轉(zhuǎn)向DAPK1-p53死亡信號(hào)。我們發(fā)現(xiàn)利用合成的小分子穿膜肽Tat-p53DM (1mg/kg)可阻斷小鼠腦組織DAPK1-p5380%的結(jié)合。TTC染色,FJ染色結(jié)果顯示,MCAO術(shù)后6小時(shí)注射1mg/kg的Tat-p53DM顯著降低了腦梗死的體積,其中Tat-s-p53DM對(duì)照組腦梗死體積為31.9±5.8mm3,而Tat-p53DM實(shí)驗(yàn)組為18.6±3.7mm3。同時(shí)Tat-p53DM大幅度地減少了在最易受損傷的大腦區(qū)域包括紋狀體和海馬區(qū)死亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。當(dāng)成年雄性小鼠卒中發(fā)作后6小時(shí)注射Tat-p53DM,在注射Tat-s-p53DM組,FJ+約為220±10/mm3,而在Tat-p53DM實(shí)驗(yàn)組,FJ+約為95±8/mmm3,說明該多肽對(duì)大腦損傷有顯著治療效果。行為學(xué)的結(jié)果顯示Tat-p53DM治療后24小時(shí)到4周的一個(gè)月觀察期顯示比對(duì)照多肽Tat-s-p53DM更好的神經(jīng)功能評(píng)分和完全恢復(fù)的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。而且我們發(fā)現(xiàn)在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中注射Tat-p53DM不影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力,自主行為和探索行為。高架實(shí)驗(yàn)顯示注射Tat-p53DM不會(huì)引起焦慮行為。Morris水迷宮結(jié)果顯示注射Tat-p53DM組與對(duì)照組空間學(xué)習(xí)記憶能力無明顯差別。因此上述結(jié)果提示,Tat-p53DM可以有效治療卒中且不影響正常生理功能。 [結(jié)論] 本研究首先聚焦DAPK1-NR2B死亡信號(hào),發(fā)現(xiàn)在興奮性神經(jīng)元中特異性敲除NR2B-CT可以干預(yù)DAPK1-NR2B相互作用有效治療卒中,但是同時(shí)影響了學(xué)習(xí)記憶功能。而利用小分子穿膜肽Tat-p53DM則可以有效阻斷DAPK1與p53的結(jié)合,通過抑制DAPK1-p53死亡信號(hào)有效保護(hù)缺血腦損傷,且不影響正常生理功能,因此干預(yù)DAPK1-p53死亡信號(hào)可能是卒中治療的首選策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743.3

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