【摘要】：[背景] 腦卒中,又稱腦中風或腦血管意外,是由腦部血液循環(huán)障礙導致大腦功能缺失為特征的一組疾病,在全世界是第三大致死病因,而在我國已經(jīng)成為第一大致死病因。然而,目前針對單個或多個腦血管危險因素誘發(fā)腦卒中的遺傳和分子“決定因素”知之甚少。同時,腦卒中發(fā)展過程中皮層神經(jīng)細胞以多種形式死亡,包括壞死、凋亡和自噬,這一復雜的細胞死亡分子信號通路仍不清楚。綜合過去30年來的研究,腦卒中細胞死亡的主要分子機理包括：興奮性神經(jīng)毒性、鈣超載和氧/氮化應激。缺血缺氧時,谷氨酸過量聚集于突觸,激活突觸后谷氨酸受體包括NMDA和AMPA受體,特別是NMDA受體起著至關重要的作用,大量Ca2+通過NMDA受體通道流入細胞內(nèi),導致Ca2+超載,并激活一系列蛋白酶、酯酶和核酶的降解過程從而引發(fā)下游致命反應,包括活性氧的產(chǎn)生,活性氮的產(chǎn)生,離子體內(nèi)失衡,線粒體功能紊亂等,最終細胞因為凋亡(DNA斷裂和染色質(zhì)凝結(jié))或壞死(腫脹、破裂和細胞溶解)或者兩者的共同作用而死亡。缺血性卒中目前唯一有效的治療是運用組織纖溶酶原激活物(tPA)進行溶栓治療。然而,由于tPA的治療存在嚴格的治療指征、有出血副作用和溶栓治療時問窗較窄(4.5小時),只有很少的患者能從中受益。因此,探討新的干預方法和治療手段保護神經(jīng)細胞來對抗缺血性卒中腦損傷極其重要。死亡相關蛋白激酶1(DAPK1)是一個編碼160KD蛋白的鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的絲氨酸-蘇氨酸激酶,我們的前期結(jié)果顯示,DAPK1與NMDA受體NR2B羧基末端(NR2B-CT)介導NMDA受體興奮性毒性作用。此外DAPK1還通過其死亡結(jié)構(gòu)域(Death Domain, DD)與p53的DNA結(jié)合域(p53DNA binding motif, p53DM)直接耦合匯聚卒中多條細胞死亡通路。但是直接干預DAPK1死亡信號能否更安全有效地治療缺血性腦卒中仍需進一步研究加以驗證。本研究將在前期工作基礎上,以谷氨酸受體偶聯(lián)的特異性細胞死亡相關蛋白DAPK1及其作用的信號分子NR2B, p53為切入點,通過運用分子遺傳手段或應用外源性小分子多肽干預DAPK1死亡信號,在細胞水平與動物整體水平進一步探討腦卒中治療的有效策略。 [目的] 本研究的目的是運用分子遺傳手段選擇性敲除興奮性神經(jīng)元中NR2B-CT,干預DAPK1-NR2B死亡信號,或應用外源性小分子多肽Tat-p53DM阻斷DAPK1-p53死亡信號,探討腦卒中治療的有效策略。 [方法] 為了驗證NMDA受體亞單位NR2B-CT介導DAPK1死亡信號參與調(diào)控缺血性卒中腦損傷,我們首先將本實驗室自主構(gòu)建的條件誘導性敲除NMDA受體NR2B-CT的點突變小鼠與在興奮性神經(jīng)元中表達Cre重組酶的Camk2a-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,雙雜后代通過他莫西芬(TAM)誘導獲得在興奮性神經(jīng)元中特異性敲除NR2B-CT的突變小鼠(012362×NR2B-CT).通過PCR和尼式染色鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型和腦組織結(jié)構(gòu)表型。然后通過免疫組織化學(IHC)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)驗證突變小鼠NR2B-CT在興奮性神經(jīng)元中的敲除。隨后,通過體外實驗OGD或氧化應激后PI染色檢測突變小鼠皮層神經(jīng)元的凋亡情況。同時通過免疫共沉淀實驗(Co-IP)檢測大腦中動脈栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)術(shù)后皮層組織NR2B與DAPK1相互作用。TTC染色,核磁共振成像(MRI), Fluoro-Jade C (FJ)染色檢測缺血后腦梗塞體積及死亡的神經(jīng)細胞數(shù)量。最后通過行為學轉(zhuǎn)棒實驗,生存率統(tǒng)計檢測MCAO術(shù)后一個月內(nèi)小鼠運動協(xié)調(diào)能力恢復情況。通過高架十字迷宮(Elevated Plus Maze)、水迷宮(Morris Water Maze)、條件恐懼實驗(Fear Conditioning)檢測成年突變小鼠焦慮情況,空間學習記憶及恐懼記憶能力。 同時,基于前期離體細胞研究結(jié)果,為了探討更為安全有效的缺血性卒中治療方法,我們運用在體小鼠MCAO缺血模型,通過合成小分子穿膜肽Tat-p53DM阻斷缺血腦區(qū)DAPK1-p53死亡信號,利用Co-IP與Western blotting檢測術(shù)后不同劑量的Tat-p53DM以及不同治療時間窗對DAPK1-p53相互作用的抑制效果,并通過TTC染色和FJ染色檢測術(shù)后腦梗塞的體積和死亡的神經(jīng)細胞數(shù)量。然后應用修訂后的神經(jīng)系統(tǒng)評分系統(tǒng)(7分制),轉(zhuǎn)棒實驗,足誤實驗(Foot Fault Test)檢測術(shù)后一個月內(nèi)小鼠經(jīng)多肽治療后神經(jīng)功能恢復情況和運動協(xié)調(diào)能力。最后通過曠場實驗(OpenField)、高架十字迷宮、水迷宮實驗檢測小鼠自主運動行為,探索行為,焦慮情況及空間學習記憶能力。 [結(jié)果] 我們發(fā)現(xiàn)在興奮性神經(jīng)元中特異性敲除NR2B-CT (012362×NR2B-CT)降低了MCAO術(shù)后皮層內(nèi)DAPK1與NR2B的結(jié)合。體外OGD實驗結(jié)果顯示012362XNR2B-CT小鼠原代培養(yǎng)的神經(jīng)元PI染色陽性(PI+)細胞數(shù)目約為對照組的40%-50%,pMLC(反映DAPK1活性),cleaved caspase3表達水平約為對照組的70%,在應用H202分別刺激1小時,2小時,3小時后,012362×NR2B-CT小鼠pI+分別為對照組的88%,40%,36%,說明體外模擬缺血時,012362×NR2B-CT小鼠神經(jīng)元死亡比率明顯降低。與OGD及氧化應激結(jié)果類似,在體模擬缺血的MCAO模型中012362×NR2B-CT小鼠成功干預了DAPK1與NR2B的結(jié)合,較野生型小鼠也顯示更少的神經(jīng)元死亡。TTC染色,MRI,FJ染色結(jié)果顯示012362×NR2B-CT小鼠腦梗塞體積和腦水腫體積明顯減小,皮層和紋狀體死亡的神經(jīng)細胞數(shù)目顯著減少。而且在術(shù)后一個月,012362×NR2B-CT小鼠存活率較對照組顯著提高,在轉(zhuǎn)棒上的停留時間較對照組顯著增加。四周時,012362XNR2B-CT突變小鼠肢體協(xié)調(diào)能力基本恢復到術(shù)前的90%。因此在興奮性神經(jīng)元中敲除的NR2B-CT干預了DAPK1-NR2B死亡信號,可有效治療卒中。但是值得注意的是,Morris水迷宮結(jié)果顯示,在“定位航行試驗”中,012362X NR2B-CT從第4天開始潛伏期顯著高于對照組,在“空間探索試驗”中012362ＸNR2B-CT小鼠顯示更長的潛伏期和較少的穿越平臺次數(shù)。這一結(jié)果提示012362×NR2B-CT小鼠空間學習記憶能力降低。條件性恐懼實驗結(jié)果顯示在檢測場景恐懼記憶時,012362×NR2B-CT小鼠僵直反應次數(shù)也明顯降低,表明其海馬依賴的恐懼記憶能力降低。 以上結(jié)果提示通過分子遺傳手段敲除與DAPK1結(jié)合的NR2B羧基末端片段干預DAPK1-NR2B死亡信號治療缺血性卒中有一定的局限性,因此,基于近期研究工作,我們將目光轉(zhuǎn)向DAPK1-p53死亡信號。我們發(fā)現(xiàn)利用合成的小分子穿膜肽Tat-p53DM (1mg/kg)可阻斷小鼠腦組織DAPK1-p5380%的結(jié)合。TTC染色,FJ染色結(jié)果顯示,MCAO術(shù)后6小時注射1mg/kg的Tat-p53DM顯著降低了腦梗死的體積,其中Tat-s-p53DM對照組腦梗死體積為31.9±5.8mm3,而Tat-p53DM實驗組為18.6±3.7mm3。同時Tat-p53DM大幅度地減少了在最易受損傷的大腦區(qū)域包括紋狀體和海馬區(qū)死亡的神經(jīng)細胞數(shù)量。當成年雄性小鼠卒中發(fā)作后6小時注射Tat-p53DM,在注射Tat-s-p53DM組,FJ+約為220±10/mm3,而在Tat-p53DM實驗組,FJ+約為95±8/mmm3,說明該多肽對大腦損傷有顯著治療效果。行為學的結(jié)果顯示Tat-p53DM治療后24小時到4周的一個月觀察期顯示比對照多肽Tat-s-p53DM更好的神經(jīng)功能評分和完全恢復的運動協(xié)調(diào)能力。而且我們發(fā)現(xiàn)在曠場實驗中注射Tat-p53DM不影響小鼠的運動能力,自主行為和探索行為。高架實驗顯示注射Tat-p53DM不會引起焦慮行為。Morris水迷宮結(jié)果顯示注射Tat-p53DM組與對照組空間學習記憶能力無明顯差別。因此上述結(jié)果提示,Tat-p53DM可以有效治療卒中且不影響正常生理功能。 [結(jié)論] 本研究首先聚焦DAPK1-NR2B死亡信號,發(fā)現(xiàn)在興奮性神經(jīng)元中特異性敲除NR2B-CT可以干預DAPK1-NR2B相互作用有效治療卒中,但是同時影響了學習記憶功能。而利用小分子穿膜肽Tat-p53DM則可以有效阻斷DAPK1與p53的結(jié)合,通過抑制DAPK1-p53死亡信號有效保護缺血腦損傷,且不影響正常生理功能,因此干預DAPK1-p53死亡信號可能是卒中治療的首選策略。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3

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