【摘要】：蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage, SAH)是高病死率和病殘率的三大腦血管疾病之一。蛛網(wǎng)膜下腔出血后蛛網(wǎng)膜下腔及腦實(shí)質(zhì)內(nèi)發(fā)生一系列復(fù)雜的病理生理改變,包括血腫形成、腦水腫、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞毒性物質(zhì)等。這些病理因素一起作用導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡,并進(jìn)一步引起神經(jīng)功能損傷。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種內(nèi)源性的危險(xiǎn)因子,可以誘導(dǎo)與外源性病原微生物相似的免疫炎性反應(yīng),在損傷相關(guān)分子模式(DAMP)炎性反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HMGB1是一種高度保守的DNA結(jié)合蛋白,作為染色體的組件,通常存在于細(xì)胞核內(nèi)。在特定情況下,HMGB1釋放至細(xì)胞外,通過(guò)TLR-Myd88-NF-κB途徑啟動(dòng)DAMP型炎性反應(yīng),并起到級(jí)聯(lián)放大作用,同時(shí)伴隨HMGB1的釋放,其表達(dá)水平也相應(yīng)升高。因此,我們提出假設(shè)：HMGB1可能是SAH后啟動(dòng)DAMP型炎性反應(yīng)的核心因子,并在SAH后早期腦損傷中發(fā)揮著極其重要的作用。本研究中,首先是要確定HMGB1在SAH后早期是否從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移出。因此我們采用Sprague-Dawley(SD)大鼠作為動(dòng)物模型,予以蛛網(wǎng)膜下腔注入自體動(dòng)脈血制作SAH模型,使用western blot、real-time PCR及免疫熒光在不同時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠腦組織內(nèi)HMGB1的位相及表達(dá)水平的變化,使用real-time PCR的方法觀察下游炎癥因子的改變,探討]HMGB1是否早期釋放。研究發(fā)現(xiàn),蛛網(wǎng)膜下腔出血早期,HMGB1即釋放至細(xì)胞外,伴隨其基因及蛋白表達(dá)水平被上調(diào)。絕大部分釋放出的HMGB1來(lái)自神經(jīng)元細(xì)胞。為進(jìn)一步明確神經(jīng)元釋放的HMGB1能否啟動(dòng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng),采用Hb刺激神經(jīng)元,去除Hb后,將神經(jīng)元的培養(yǎng)液置換給混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),觀察膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的程度。結(jié)果提示Hb能夠刺激神經(jīng)元釋放HMGB1至細(xì)胞培養(yǎng)基中,而去除了Hb的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基能夠上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)。當(dāng)給予HMGB1特異性抑制劑甘草酸銨鹽(GA)干預(yù)后,能夠逆轉(zhuǎn)上調(diào)的炎性反應(yīng),這個(gè)結(jié)果提示神經(jīng)元釋放的HMGB1能夠發(fā)揮促炎反應(yīng)的作用。為進(jìn)一步明確HMGB1在早期腦損傷中的作用,因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)給予蛛網(wǎng)膜下腔注射重組人HMGB1 (rHMGB1),使用western blot觀察不同時(shí)間點(diǎn)腦組織核蛋白內(nèi)NF-κB(P65)的含量,real-time PCR測(cè)定下游炎性因子的基因表達(dá)水平,明確HMGB1的促進(jìn)炎性反應(yīng)的性質(zhì),并用cleaved-caspase 3與神經(jīng)元免疫共染色評(píng)價(jià)組織凋亡程度,反應(yīng)早期腦損傷情況。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外的HMGB1能夠激活腦組織細(xì)胞內(nèi)的NF-κB,引起下游炎癥因子的升高,加重神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。本課題的另一個(gè)目標(biāo)是研究HMGB1在神經(jīng)系統(tǒng)中通過(guò)何種信號(hào)通路引起炎性反應(yīng)。我們引入TLR4受體的拮抗劑TAK242,在蛛網(wǎng)膜下腔給予rHMGB1后半小時(shí)通過(guò)側(cè)腦室給藥TAK242,比較1天后各分組內(nèi)P65含量及炎性因子基因表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn),TLR4受體拮抗劑TAK242能夠逆轉(zhuǎn)HMGB1導(dǎo)致的NF-κB (P65)含量的上升及炎性因子的增加,研究結(jié)果表明TLR4在HMGB1引起的神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)中起著重要的作用。為進(jìn)一步以HMGB1為治療靶點(diǎn),尋找潛在性治療藥物,我們引入HMGB1特異性的抑制劑甘草酸銨鹽(GA),能夠通過(guò)血腦屏障,并抑制HMGB1在細(xì)胞外的活性。在自體血SAH造模后半小時(shí)通過(guò)靜脈給予甘草酸治療,比較不同治療組及未治療組腦組織內(nèi)炎癥因子的變化,腦水腫的程度以及腦組織細(xì)胞凋亡及壞死的程度。研究結(jié)果表明使用甘草酸治療能夠抑制HMGB1向細(xì)胞外的釋放,減輕炎性反應(yīng)及腦水腫,減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及死亡,達(dá)到減輕腦損傷的作用。綜上所述,HMGB1在SAH后早期由神經(jīng)元釋放,釋放出的HMGB1能夠影響周邊的膠質(zhì)細(xì)胞,主要通過(guò)TLR4受體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷中起著至關(guān)重要的作用,HMGB1可能是SAH后炎性反應(yīng)的重要起始因素之一。甘草酸通過(guò)抑制細(xì)胞外HMGB1的活性以及抑制HMGB1的釋放,起著重要的神經(jīng)保護(hù)作用。HMGB1可能成為SAH干預(yù)的新的靶點(diǎn)。
[Abstract]:Subarachnoid hemorrhage (SAH) is one of the three major cerebrovascular diseases with high mortality and disability. After SAH, a series of complex pathophysiological changes occur in the subarachnoid space and brain parenchyma, including hematoma formation, brain edema, oxidative stress, inflammatory reaction, cytotoxic substances and so on. High mobility group protein 1 (HMGB1) is an endogenous risk factor that can induce similar immuno-inflammatory responses to exogenous pathogenic microorganisms and plays a key role in the inflammatory response of damage-associated molecular model (DAMP). Degree-conserved DNA-binding proteins, as components of chromosomes, are usually present in the nucleus. Under certain conditions, HMGB1 is released into the extracellular space to initiate DAMP-type inflammatory response via the TLR-Myd88-NF-kappa B pathway, which acts as a cascade amplifier. At the same time, the expression level of HMGB1 increases with the release of HMGB1. In this study, the first step was to determine whether HMGB1 was transferred from the nucleus early after SAH. So we used Sprague-Dawley (SD) rats as animal models and injected subarachnoid space into autologous arteries. The changes of HMGB1 phase and expression level in rat brain tissues were observed by Western blot, real-time PCR and immunofluorescence at different time points. The changes of downstream inflammatory factors were observed by real-time PCR to explore whether HMGB1 was released in early stage of SAH. Most of the HMGB1 released from neurons came from neurons. To further determine whether the HMGB1 released by neurons could initiate the inflammatory reaction of glial cells, Hb was used to stimulate neurons. After removal of Hb, the cultured neurons were replaced by mixed glial cells to observe the glial fineness. The results suggest that Hb can stimulate neurons to release HMGB1 into the cell culture medium, while the neutrophil culture medium without Hb can up-regulate the inflammatory response of glial cells. In order to further clarify the role of HMGB1 in early brain injury, a subarachnoid injection of recombinant human HMGB1 (rHMGB1) was designed to observe the content of NF-kappa B (P65) in the nucleoprotein of brain tissues at different time points by Western blot and determine the gene table of downstream inflammatory factors by real-time PCR. It was found that extracellular HMGB1 could activate NF-kappa B in brain tissue cells, induce the increase of downstream inflammatory factors and aggravate the apoptosis of nerve cells. Another goal was to investigate the signaling pathways through which HMGB1 causes inflammatory responses in the nervous system. We introduced TAK242, an antagonist of TLR4 receptor, and then subarachnoid rHMGB1 was administered to TAK242 via the lateral ventricle half an hour later to compare the levels of P65 and the expression of inflammatory factor genes in each group one day later. AK242 can reverse the increase of NF-kappa B (P65) and inflammatory factors induced by HMGB1. The results indicate that TLR4 plays an important role in the inflammatory response of the nervous system induced by HMGB1. In order to find potential therapeutic drugs for HMGB1, ammonium glycyrrhizinate (GA), a specific inhibitor of HMGB1, can be introduced. Glycyrrhizic acid was administered intravenously half an hour after autologous blood SAH modeling. The changes of inflammatory factors, the degree of brain edema and the degree of apoptosis and necrosis of brain tissue in different treatment groups and untreated groups were compared. The results showed that glycyrrhizic acid could be used to treat SAH. To sum up, HMGB1 released by neurons in the early stage after SAH can affect peripheral glial cells, mainly through TLR4 receptor-mediated inflammatory response in the subarachnoid space. HMGB1 may be one of the important initiating factors of inflammation after SAH. Glycyrrhizin plays an important neuroprotective role by inhibiting the activity of extracellular HMGB1 and inhibiting the release of HMGB1. HMGB1 may become a new target of SAH intervention.
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R743.35

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本文編號(hào)：2212769