【摘要】：第一部分星形細(xì)胞經(jīng)由TGF-β誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤血管擬態(tài)形成及其機(jī)制研究研究背景膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見且最致命的原發(fā)性腫瘤。其快速增殖及廣泛浸潤的生長特點(diǎn)為外科手術(shù)治療帶來了極大的困難。由于腫瘤的增殖和侵襲均需要誘導(dǎo)大量的血管生成來為其提供必要的營養(yǎng)支持,因而應(yīng)用抗血管生成藥物治療膠質(zhì)瘤的潛力倍受矚目。然而,近期的研究結(jié)果表明盡管抗血管生成藥物可以在一定程度上抑制膠質(zhì)瘤的進(jìn)展,但對于膠質(zhì)瘤患者的總生存期并無明顯的改善作用。更令人擔(dān)憂的是,抗血管治療甚至可能增強(qiáng)膠質(zhì)瘤在缺血缺氧條件下的適應(yīng)性進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力。1999年腫瘤血管擬態(tài)的概念被提出,研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)部除正常血管外還存在一種特殊結(jié)構(gòu)由腫瘤細(xì)胞代替正常血管內(nèi)皮細(xì)胞以供血漿及血細(xì)胞從中通過,從而為快速增殖進(jìn)展的腫瘤提供必要的營養(yǎng)支持。目前腫瘤血管擬態(tài)結(jié)構(gòu)已被發(fā)現(xiàn)于包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤當(dāng)中,并且其陽性率與腫瘤的進(jìn)展程度密切相關(guān)。因而,腫瘤血管擬態(tài)在腫瘤內(nèi)的廣泛存在可能是導(dǎo)致抗血管治療失效的重要原因。所以在對膠質(zhì)瘤病人進(jìn)行抗血管治療的同時,抗腫瘤血管擬態(tài)的藥物也應(yīng)當(dāng)被合并應(yīng)用。然而目前關(guān)于這種藥物的研究并不多見。在顱內(nèi),膠質(zhì)瘤所導(dǎo)致的缺血缺氧環(huán)境會不斷募集周圍的星形細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞。因而人們可以經(jīng)常在膠質(zhì)瘤及顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的周圍發(fā)現(xiàn)活化的星形細(xì)胞的存在。盡管星形細(xì)胞的基本功能是保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞,然而對于膠質(zhì)瘤,星形細(xì)胞也具有可以通過旁分泌的途徑激活膠質(zhì)瘤增殖的有關(guān)基因同時增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的耐藥性。除此之外瘤旁的星形細(xì)胞也可以通過旁分泌的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞多種原癌基因的表達(dá),從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖,遷移及侵襲能力的增加。而在星形細(xì)胞分泌的眾多細(xì)胞因子當(dāng)中,TGF-β因其對腫瘤進(jìn)展的重要作用而備受矚目。Galunisertib(LY2157299)是一種ATP的類似物同時也是TGF-βRI的一種特異性阻斷劑,作為僅有的幾種TGF-β的抑制劑藥物,其正在進(jìn)行的臨床IV期實(shí)驗顯示其對膠質(zhì)瘤預(yù)后具有較好的改善效果。然而目前關(guān)于其具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的討論同時該藥物與星形細(xì)胞之間的關(guān)系也需要進(jìn)一步的研究。從而為其將來進(jìn)一步的應(yīng)用打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。研究目的膠質(zhì)瘤作為一種致死率較高的腫瘤,其極強(qiáng)的侵襲性及浸潤生長的特點(diǎn)為外科手術(shù)治療帶來了極大的難度。目前關(guān)于膠質(zhì)瘤的研究認(rèn)為顱內(nèi)血管擬態(tài)水平與膠質(zhì)瘤預(yù)后有直接相關(guān)關(guān)系。因而本研究主要集中探討了星形細(xì)胞是否經(jīng)由TGF-β2調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤腫瘤血管擬態(tài)形成,及由此產(chǎn)生的生物學(xué)及臨床意義。研究方法和結(jié)果1.人星形細(xì)胞可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系形成腫瘤血管擬態(tài)通過免疫組化(IHC)明確星形細(xì)胞在膠質(zhì)瘤中的分布,通過Brdu增殖實(shí)驗及Transwell侵襲實(shí)驗明確了星形細(xì)胞對膠質(zhì)瘤侵襲及增殖的作用,通過添加基質(zhì)膠及應(yīng)用Transwell、室,構(gòu)建星形細(xì)胞／膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)模型及體外VM形成實(shí)驗,研究結(jié)果顯示：星形細(xì)胞能夠明確地誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成腫瘤血管擬態(tài)。2.星形細(xì)胞誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤血管擬態(tài)形成依賴TGF-β1的分泌而Galunisertib可抑制該作用。通過向星形細(xì)胞／膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)模型中加入貝伐單抗,我們發(fā)現(xiàn)抑制VEGF通路對腫瘤血管擬態(tài)的形成并沒有起到顯著的抑制作用,通過應(yīng)用懸浮芯片篩查,我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達(dá)量在星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)后顯著增高,而同時RT-PCR, ELISA的結(jié)果也驗證了我們這一結(jié)論,之后我們通過向膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中添加外源性TGF-β1及TGF-β1的抑制劑證明了,星形細(xì)胞通過分泌TGF-β1的方式誘導(dǎo)了膠質(zhì)瘤細(xì)胞系腫瘤血管擬態(tài)的形成,而Western blot的結(jié)果也驗證了TGF-β1的來源。在明確星形細(xì)胞誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤腫瘤血管擬態(tài)形成的作用后,我們嘗試在星形細(xì)胞/膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)模型中應(yīng)用貝伐單抗來抑制這一作用,然而結(jié)果并不理想。為了探明星形細(xì)胞影響膠質(zhì)瘤腫瘤血管擬態(tài)形成的具體機(jī)制,我們應(yīng)用懸浮芯片技術(shù)對共培養(yǎng)模型的上清進(jìn)行了篩選,通過對200多種細(xì)胞因子的篩查,我們發(fā)現(xiàn)TGF-β的表達(dá)在共培養(yǎng)模型中有顯著的上升,而也有相關(guān)的文獻(xiàn)報道TGF-β可能參與了腫瘤血管的發(fā)育形成。之后我們應(yīng)用RT-PCR及ELISA的技術(shù)對上一結(jié)論進(jìn)行了驗證,明確了TGF-β表達(dá)水平在共培養(yǎng)后的變化。通過將外源性TGF-β因子加入到膠質(zhì)瘤細(xì)胞系當(dāng)中,我們發(fā)現(xiàn)能夠得到與星形細(xì)胞/膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)類似的結(jié)果。而在向共培養(yǎng)模型中添加了TGF-β的抑制劑Galunisertib后,腫瘤則無法有效的形成血管擬態(tài)。結(jié)合Western blot的結(jié)果,我們認(rèn)為來源于星形細(xì)胞的TGF-β參與了膠質(zhì)瘤腫瘤血管擬態(tài)的形成并在其中發(fā)揮了重要的作用。3. Galunisertib可以經(jīng)由Akt, Flk抑制、E-cadherin及SMa的表達(dá)。首先通過Western blot我們發(fā)現(xiàn)星形細(xì)胞可以顯著增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)腫瘤血管擬態(tài)的相關(guān)標(biāo)志物VE-cadherin、SMαβMMP2及MMP9,而Galunisertib可以顯著抑制這些標(biāo)志物的表達(dá)。同時Western blot也顯示星形細(xì)胞誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤腫瘤血管擬態(tài)這一過程中伴隨著Akt及Flk信號通路的變化及細(xì)胞自噬水平的改變,而之后我們通過免疫熒光對VE-cadherin及SMa進(jìn)行了驗證,也得到了相似的結(jié)果。在明確信號通路的改變后,我們應(yīng)用相關(guān)信號通路的抑制劑對Akt及Flk通路進(jìn)行了體外成管實(shí)驗及Western blot驗證,并得到了相應(yīng)的結(jié)果。4. Galunisertib可抑制膠質(zhì)瘤自噬進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤腫瘤擬態(tài)的形成通過Western blot我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤自噬的標(biāo)志物L(fēng)C3B及P62在添加TGF-β刺激后及加入Galunisertib后均發(fā)生了顯著改變。而同時根據(jù)我們對轉(zhuǎn)染GFP-LC3B慢病毒后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行定量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),自噬陽性細(xì)胞的比率也顯著增加。另通過自噬檢驗的金標(biāo)準(zhǔn)透射電鏡,結(jié)果也顯示：TGF-β可促進(jìn)膠質(zhì)瘤自噬水平的增強(qiáng)而Galunisertib則起到抑制作用。細(xì)胞的自噬水平一直與其能量代謝水平緊密相連,因而我們通過借助Seahorse XFe24能量代謝分析儀發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞其能量代謝水平顯著增加,而加入Galunisertib后期代謝水平則呈較低水平。而體外的成管實(shí)驗也證明,通過抑制自噬可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤血管擬態(tài)的形成。5. Galunisertib在體外荷瘤模型中抑制了腫瘤的生長和腫瘤血管擬態(tài)的形成我們首先在NOD-SCID小鼠皮下接種了約1x107的膠質(zhì)瘤細(xì)胞,之后定期測量腫瘤的直徑及小鼠的體重,并在約5周左右時統(tǒng)一處死。對取得的皮下腫瘤體積及重量進(jìn)行定量分析,同時進(jìn)行石蠟包埋并進(jìn)行免疫組化分析,利用CD34/PAS雙染統(tǒng)計腫瘤血管擬態(tài)的陽性率。研究結(jié)果顯示：Galunisertib在體外荷瘤模型中抑制了腫瘤的生長和腫瘤血管擬態(tài)的形成。結(jié)論1.星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成腫瘤血管擬態(tài)。2.星形膠紙細(xì)胞主要通過分泌TGF-β的方式誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤形成腫瘤血管擬態(tài)而Galunisertib能夠抑制這一過程的產(chǎn)生。3. Galunisertib抑制了VE-cadherin, SMa等腫瘤血管擬態(tài)標(biāo)志物的表達(dá)從而抑制了腫瘤血管擬態(tài)的產(chǎn)生而該過程主要經(jīng)由Akt,Flk信號通路。4. Galunisertib可抑制膠質(zhì)瘤自噬進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤腫瘤擬態(tài)的形成。5.通過抑制自噬可以抑制腫瘤的代謝活動進(jìn)而影響腫瘤血管擬態(tài)形成。第二部分TGF-β經(jīng)由自噬對膠質(zhì)瘤侵襲的影響及其機(jī)制研究研究背景惡性腦腫瘤基于其極強(qiáng)的增殖能力、侵襲能力及化療抗性因而被看作是最難治療的腫瘤之一。盡管目前針對腫瘤的原癌基因及血管生成等機(jī)制為靶點(diǎn)已經(jīng)開發(fā)了多種藥物,然而并沒有顯著地改善膠質(zhì)瘤患者的生存期。因而人們目前仍然急切地需要加深對膠質(zhì)瘤成瘤機(jī)制的認(rèn)知。越來越多的研究顯示,腫瘤微環(huán)境尤其是多種多樣的細(xì)胞因子誘導(dǎo)了腫瘤的惡性生物學(xué)行為的產(chǎn)生。而其中’TGF-β被報道與膠質(zhì)瘤的侵襲能力密切相關(guān),目前的臨床證據(jù)顯示,約有95%的膠質(zhì)瘤患者在病程的晚期可以檢測到明顯的TGF-β表達(dá)水平升高,而除此之外-TGF-β也與腫瘤上皮間充的轉(zhuǎn)化密切相關(guān),而這一過程往往提示了腫瘤侵襲能力的增強(qiáng)。目前自噬作為腫瘤的研究熱點(diǎn),其在膠質(zhì)瘤中的作用也被人越來越關(guān)注。目前的研究表明,自噬可以影響膠質(zhì)瘤的侵襲能力,膠質(zhì)瘤的能量代謝水平及膠質(zhì)瘤的P53原癌基因的表達(dá)。目前有研究認(rèn)為TGF-β可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞中的自噬水平而這一過程與肝癌細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)。而關(guān)于TGF-β關(guān)于自噬影響膠質(zhì)瘤侵襲的具體機(jī)制尚未見報道。因此在本研究中我們集中探討了TGF-β與自噬的關(guān)系并。研究目的本研究的主要目的在于通過分析TGF-β對膠質(zhì)瘤自噬水平的影響,進(jìn)而揭示該過程的生物學(xué)意義及對膠質(zhì)瘤發(fā)生的影響。通過深入分析自噬影響膠質(zhì)瘤侵襲機(jī)制的原因,從而為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的理論支持。研究方法和結(jié)果1.TGF-β及LC3B在人膠質(zhì)瘤中均高度表達(dá)并呈明顯的相關(guān)關(guān)系且與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后有關(guān)通過對不同等級膠質(zhì)瘤切片進(jìn)行IHC染色并應(yīng)用Pearson法進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,我們發(fā)現(xiàn)TGF-β及LC3B隨腫瘤等級升高表達(dá)明顯增加且存在一定的正相關(guān)關(guān)系,同時我們也進(jìn)行了免疫熒光的共定位分析及原代腫瘤地RG--PCR分析,并得到了類似的結(jié)論。之后我們通過對歷年55例病例進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,認(rèn)為TGF-β及LC3B的高表達(dá)顯著影響病人的預(yù)后。2.TGF-β以時間依賴及劑量依賴的方式調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬水平通過對三種不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251,T98,U87進(jìn)行Wlestern blot分析,我們發(fā)現(xiàn)隨著TGF-β濃度的不斷提高,膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的自噬水平也不斷升高(LC3B),而這一過程在加入TGF-β后的24小時達(dá)到高峰。而通過轉(zhuǎn)染GFP-LC3B慢病毒及透射電鏡,我們可以得到類似的結(jié)論。而在加入了自噬的抑制劑3-MA及Baf后,我們發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)的自噬可能是發(fā)生于非：mTOR依賴的途徑,同時相關(guān)的Microarray分析也發(fā)現(xiàn)了自噬相關(guān)基因的變化。3.TGF-β誘導(dǎo)的自噬參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲過程然而對膠質(zhì)瘤的增殖并不產(chǎn)生影響。通過Western blot我們首先對即將應(yīng)用的siATG5,siATG7質(zhì)粒的干擾效率進(jìn)行驗證,之后通過Brdu增殖實(shí)驗,我們發(fā)現(xiàn)干擾自噬后,對TGF-β誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并無明顯影響。而之后通過劃痕及Transwell侵襲實(shí)驗,我們發(fā)現(xiàn)干擾自噬后,可以顯著影響TGF-β誘導(dǎo)的侵襲能力增強(qiáng),因而我們認(rèn)為,TG-—β誘導(dǎo)自噬這一過程主要在膠質(zhì)瘤侵襲中發(fā)揮作用。4.抑制自噬可抑制-TGF-β誘導(dǎo)的MMP及EMT標(biāo)志物的表達(dá)通過對三種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系13種不同MMP蛋白的RT-PCR結(jié)果分析,我們發(fā)現(xiàn)TGF-β能夠顯著促進(jìn)MMP轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)而自噬抑制劑Baf可以抑制這一現(xiàn)象。通過MMP2,MMP9的ELISA分析,我們也可以得到類似的結(jié)論。之后我們利用Western blot對EMT的標(biāo)志物也進(jìn)行了驗證,發(fā)現(xiàn)抑制自噬也同樣可以抑制TGF-β誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)化,而通過對N-cadherin及Vimentin的免疫熒光檢驗,我們也可以發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)論。5.TGF-β經(jīng)由自噬調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的能力代謝重排首先通過應(yīng)用Mitotracker對膠質(zhì)瘤的線粒體進(jìn)行染色,我們發(fā)現(xiàn)TGF-β可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞線粒體的融合,而在應(yīng)用Baf后該過程被阻斷。同時,通過對標(biāo)記線粒體的位置進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)TGF-β同樣對線粒體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的位置分布產(chǎn)生了影響,而自噬參與了這一過程。之后我們通過、Vestern blot對線粒體融合過程中Mfn1/2,OPA1,Drp1等蛋白進(jìn)行分析,從分子角度上驗證了我們的結(jié)論。而之后通過應(yīng)用JC-1分子探針及流式細(xì)胞術(shù)我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),TGF-β在影響線粒體分裂/融合的同時也影響了線粒體膜電位的變化,而之后我們通過應(yīng)用Seahorse能量代謝分析儀進(jìn)一步明確了TGF-β經(jīng)由自噬調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞能力代謝的具體作用。6.TGF-β經(jīng)由JNK及Smad信號通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的自噬水平根據(jù)既往的文獻(xiàn),我們首先通過Western blot發(fā)現(xiàn)TGF-β并非經(jīng)由傳統(tǒng)的AKT-mTOR通路激活細(xì)胞的自噬而是經(jīng)由JNK通路對自噬產(chǎn)生了影響。由于TGF-β信號通路的下游存在Smad依賴及非Smad依賴兩條途徑,因而我們通過應(yīng)用siSmad2干擾質(zhì)粒也發(fā)現(xiàn)其對TGF-β誘導(dǎo)的自噬產(chǎn)生了影響。而同時經(jīng)由Western blot及ELISA我們也可以觀察到自噬對TGF-β的正反饋調(diào)節(jié)作用。之后通過應(yīng)用TGF-β抑制劑及自噬抑制劑,我們進(jìn)一步探討了TGF-β調(diào)節(jié)自噬的可能機(jī)制,及TGF-β-autophagy-Lactate-TGF-β這一正反饋軸的可能性。7. Galunisertib及CQ的聯(lián)合應(yīng)用可降低膠質(zhì)瘤的侵襲性并延長荷瘤小鼠生存期首先我們在NOD-SCID免疫缺陷的小鼠身上利用立體定向裝置進(jìn)行了膠質(zhì)瘤的原位種植,并將老鼠分為三組：對照組、單藥應(yīng)用組及聯(lián)合用藥組。并應(yīng)用3.0T MRI對小鼠顱內(nèi)的腫瘤體積進(jìn)行定期觀察,并統(tǒng)計小鼠的生存期。結(jié)果顯示,聯(lián)合應(yīng)用藥物的小鼠生存顯著延長。而將小鼠顱內(nèi)的腫瘤取出并進(jìn)行石蠟包埋,HE及IHC染色后我們可以發(fā)現(xiàn),聯(lián)合應(yīng)用藥物的腫瘤邊緣浸潤顯著減少表明腫瘤的侵襲性減弱,同時IHC的結(jié)果表明Galunisert.b及CQ的聯(lián)合應(yīng)用也可以顯著降低小鼠腫瘤內(nèi)的TGF-β水平。結(jié)論1.TGF-β及LC3B在人膠質(zhì)瘤中均成高表達(dá)且均與患者的生存期相關(guān)。2.TGF-β能夠以時間依賴及濃度依賴的方式誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤自噬水平的升高。3.TGF-β誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤自噬參與了腫瘤的侵襲及遷移。4.MMP蛋白及EMT轉(zhuǎn)化可能是自噬影響膠質(zhì)瘤侵襲的機(jī)制之一。5.TGF-β誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤自噬同樣對腫瘤代謝產(chǎn)生影響。6.TGF-β可能通過JNK及Smad通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的自噬水平。7.聯(lián)合應(yīng)用Galunisertib及CQ可顯著改善種瘤小鼠的生存期。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
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本文編號：2201311