【摘要】：目的:生長(zhǎng)阻斷及DNA損傷誘導(dǎo)因子45b(Growth arrest and DNA-damage inducible protein beta,Gadd45b)屬于Gadd45家族,被證實(shí)與神經(jīng)元活動(dòng)有關(guān),這與神經(jīng)的發(fā)生密切的相關(guān)。大鼠的腦缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)Gadd45b在蛋白和核酸水平的表達(dá),Gadd45b介導(dǎo)了神經(jīng)元的凋亡,可能與軸突可塑性和卒中后腦康復(fù)有關(guān)。細(xì)胞的死亡方式包括了凋亡、自噬和壞死。自噬性細(xì)胞死亡作為II型程序性細(xì)胞死亡,被證實(shí)參與了腦缺血再灌注損傷這一病理過程。然而,在此病理過程中Gadd45b對(duì)自噬的作用并不清楚。此外,在腦缺血中,Gadd45b可以促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表達(dá),與軸突的可塑性而相關(guān),Gadd45b在腦缺血中可能起著促進(jìn)康復(fù)的作用。然而,在腦缺血病理過程中,Gadd45b表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。泛素-蛋白酶系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system,UPS)廣泛調(diào)控了細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解。Gadd45的表達(dá)受到了泛素化方式的調(diào)控。但是,腦缺血再灌注損傷如何誘導(dǎo)Gadd45b表達(dá)及所涉及的具體機(jī)制也不清楚。本研究以進(jìn)一步探討和分析在腦缺血再灌注損傷的病理過程中Gadd45b對(duì)自噬的作用和可能的作用機(jī)制,以及泛素化系統(tǒng)Huwe1對(duì)Gadd45b的作用,以及兩者在卒中后腦可塑性中的作用機(jī)制。方法:采用大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng),并予以缺氧缺糖/再灌注處理(oxygen-glucosedeprivationandreperfusion,ogd/r),即ogd3h和再灌注0h、6h、24h、48h、72h和120h。cck-8和ldh試劑盒用于檢測(cè)皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活性和損傷情況。構(gòu)建慢病毒shrna-gadd45b沉默gadd45b的表達(dá),利用蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)自噬分子(atg5、lc3、beclin-1、atg7、atg3)、凋亡通路分子(bax、bcl-2、cleavedcaspase3、p53)以及jnk/p38信號(hào)通路的表達(dá)變化。同時(shí),給予自噬抑制劑或jnk/p38通路抑制劑共處理,檢測(cè)相關(guān)分子的蛋白表達(dá)變化情況,并利用tunel技術(shù)檢測(cè)皮層神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡情況。利用神經(jīng)元標(biāo)記物tuj1和lc3b免疫熒光染色雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元的軸突損傷。此外,構(gòu)建慢病毒shrna-huwe1沉默huwe1的表達(dá)變化,采用co-ip檢測(cè)huwe1和gadd45b的相互作用,進(jìn)行chx處理檢測(cè)huwe1對(duì)gadd45b蛋白穩(wěn)定性的分析,采用bsp檢測(cè)huwe1和gadd45b對(duì)bdnfixa甲基化的作用,采用westernblot技術(shù)檢測(cè)huwe1和gadd45b對(duì)bdnf及其受體trkb和p75ntr和下游效應(yīng)分子的影響。結(jié)果:在ogd/r處理神經(jīng)元細(xì)胞后,皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活性降低,隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。gadd45b在ogd/r24h時(shí)表達(dá)最高,給予慢病毒shrna沉默gadd45b后,gadd45b在再灌注24h時(shí)表達(dá)明顯的降低,增加了自噬通路的信號(hào)分子(beclin-1、atg5、atg7和atg3)、lc3ii/lc3i的比值和凋亡蛋白bax和cleavedcaspase3的表達(dá),但是降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。與此同時(shí),慢病毒shRNA-Gadd45b和自噬通路抑制劑3-MA或Wortmannin共處理后,可部分抑制LC3 II/LC3 I的比例,輕微緩解了神經(jīng)元的凋亡。沉默Gadd45b表達(dá)后,自噬相關(guān)通路p-p38磷酸化水平降低,而凋亡相關(guān)通路p-JNK磷酸化水平增加。給予慢病毒shRNA-Gadd45b和p38通路抑制劑共處理后則明顯誘導(dǎo)了自噬,而給予慢病毒shRNA-Gadd45b和JNK通路抑制劑共處理后則明緩解了細(xì)胞凋亡。OGD/R 24 h后,沉默Huwe1表達(dá)后明顯增加了Gadd45b和BDNF的表達(dá)。CO-IP結(jié)果表明Huwe1和Gadd45b存在相互作用。通過CHX處理后抑制了內(nèi)源性的Gadd45b的表達(dá),CHX和慢病毒shRNA-Huwe1共處理后則增加了Gadd45b的表達(dá)。慢病毒shRNA-Gadd45b處理后降低了BDNF和下游效應(yīng)分子的表達(dá),而慢病毒shRNA-Huwe1處理后增加了BDNF和下游效應(yīng)分子表達(dá)。沉默Huwe1表達(dá)后降低了BDNF IXa第五個(gè)CpG島甲基化水平,而沉默Gadd45b表達(dá)后則增加了BDNF IXa第四個(gè)CpG島甲基化水平。結(jié)論:在皮層神經(jīng)元OGD/R的病理過程中Gadd45b調(diào)節(jié)了凋亡和自噬,Gadd45b的表達(dá)受到了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)Huwe1的調(diào)節(jié),Gadd45b和Huwe1介導(dǎo)了BDNF IXa的甲基化。這可能為缺血性腦卒中的病理過程的研究提供新的理論基礎(chǔ),為日后的臨床治療提供可能的靶點(diǎn)。
[Abstract]:AIM: Growth arrest and DNA-damage inducible protein beta (Gadd45b) belongs to the Gadd45 family and has been proved to be associated with neuronal activity, which is closely related to neurogenesis. Neuronal apoptosis may be associated with axonal plasticity and post-stroke rehabilitation. Cell death patterns include apoptosis, autophagy and necrosis. Autophagic cell death, as a type II programmed cell death, has been shown to be involved in the pathological process of cerebral ischemia-reperfusion injury. However, the role of Gadd45b in autophagy is not apparent during this pathological process. In addition, Gadd45b can promote the expression of brain derived neurotrophic factor (BDNF) in cerebral ischemia, which is related to the plasticity of axons. Gadd45b may play a role in promoting rehabilitation in cerebral ischemia. Ubiquitin-proteasome system (UPS) regulates the degradation of intracellular proteins extensively. Gadd45 expression is regulated by ubiquitination. However, how the expression of Gadd45b is induced by cerebral ischemia-reperfusion injury and the specific mechanisms involved are unclear. This study aims to further explore and analyze the role of UPS in cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods: Rat cortical neurons were primary cultured and treated with oxygen-glucose deprivation and reperfusion (og). D / r, i.e. ogd3h and reperfusion 0h, 6h, 24h, 48h, 72h and 120h. CCK-8 and LDH kits were used to detect the activity and damage of cortical neurons. lentivirus shrna-gadd45b was constructed to silence the expression of gadd45b, and autophagy (atg5, lc3, beclin-1, atg7, atg3), apoptotic pathway molecules (bax, bcl-2, cleaspase 3, p53) were detected by Western blotting. At the same time, autophagy inhibitors or JNK / p38 pathway inhibitors were given to detect the expression of related molecules, and TUNEL technique was used to detect the apoptosis of cortical neurons. In addition, the expression of huwe1 was silenced by lentivirus shrna-huwe1, the interaction between huwe1 and Gadd45b was detected by co-ip, the stability of Gadd45b was analyzed by CHX treatment, the methylation of bdnfixa by huwe1 and Gadd45b was detected by bsp, and the effect of huwe1 and Gadd45b on BDNF and BDNF was detected by Western blot. Results: After treatment with OGD / r, the activity of cortical neurons decreased gradually with the prolongation of reperfusion time. The expression of Gadd45b was the highest at 24 hours of OGD / r24. After silencing Gadd45b with lentivirus shrna, the expression of Gadd45b was significantly decreased and increased at 24 hours of reperfusion. The autophagy pathway signaling molecules (beclin-1, atg5, Atg7 and atg3), the ratio of lc3ii / lc3i and the expression of apoptotic proteins Bax and cleavedcaspase 3 were decreased, but the expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2 was decreased. At the same time, the co-treatment of lentivirus shRNA-Gadd45b and autophagy pathway inhibitor 3-MA or Wortmannin partially inhibited the ratio of LC3 II / LC3 I. After silencing the expression of Gadd45b, the phosphorylation level of p-p38 in the autophagy-related pathway decreased, while that of p-JNK in the apoptosis-related pathway increased. Co-treatment with lentivirus shRNA-Gadd45b and p38 pathway inhibitors significantly induced autophagy, whereas co-treatment with lentivirus shRNA-Gadd45b and JNK pathway inhibitors induced autophagy. After 24 hours of OGD/R, the expression of Gadd45b and BDNF was significantly increased after Huwe1 was silenced. CO-IP results showed that Huwe1 interacted with Gadd45b. After CHX treatment, the expression of endogenous Gadd45b was inhibited, while the expression of Gadd45b was increased after CHX and lentivirus shRNA-Huwe1 co-treatment. After treatment, the expression of BDNF and downstream effector molecule was decreased, while the expression of BDNF and downstream effector molecule was increased after treatment with lentivirus shRNA-Huwe1. After silencing Huwe1 expression, the methylation level of the fifth CpG island of BDNF-IXa was decreased, while after silencing Gadd45b expression, the methylation level of the fourth CpG island of BDNF-IXa was increased. Gadd45b regulates apoptosis and autophagy in the pathological process of R. The expression of Gadd45b is regulated by the ubiquitin-proteasome system Huwe1. Gadd45b and Huwe1 mediate the methylation of BDNF IXa.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743.3

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本文編號(hào)：2193015