【摘要】：Pannexin-1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子及谷氨酸的影響研究背景星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞,具有支持、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元,維持內(nèi)外環(huán)境中pH值、神經(jīng)遞質(zhì)及離子濃度穩(wěn)定,接收、處理、傳遞信號(hào)及免疫調(diào)控等功能,其形態(tài)及功能的異常將會(huì)引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境平衡的紊亂,導(dǎo)致疾病的發(fā)生與發(fā)展�？p隙連接(Gap junctions, GJs)是相鄰細(xì)胞間重要的連接通道,幾乎存在于所有動(dòng)物的細(xì)胞膜上,能夠允許小分子及離子在相鄰細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞的增殖與分化、免疫炎癥及缺血缺氧性損傷等生理和病理過(guò)程中起重要作用。Pannexins (Panxs)是2000年新發(fā)現(xiàn)的縫隙連接蛋白家族,Panx-1作為Panxs蛋白家族中的重要成員之一,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛,可以在星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上形成半通道,能夠允許分子量低于1kDa的小分子物質(zhì)如離子、代謝分子、第二信使(Ca2+、ATP等)及神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)。研究發(fā)現(xiàn),Panx-1蛋白的功能與經(jīng)典的縫隙連接蛋白Connexins (Conxs)存在部分重疊,且多種Conxs的拮抗劑也可作用于Panx-1,因此Panx-1可能執(zhí)行了部分既往認(rèn)為是屬于Conxs的功能,如細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、細(xì)胞因子及谷氨酸的釋放等。中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)及興奮-抑制環(huán)路的失衡參與了腦血管病、癲癇及神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。因此,明確Panx-1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子及谷氨酸的影響將為進(jìn)一步明確以上神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)。在研究中我們同時(shí)觀察到處于分裂增殖期的人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87 malignant glioma cells, U87-MG) Panx-1蛋白表達(dá)增高,星形膠質(zhì)細(xì)胞增生作為星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的一種形式,將會(huì)導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞電生理及生物學(xué)功能發(fā)生改變,因此我們采用siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)觀察Panx-1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖能力的影響。材料與方法本研究共分兩部分：第一部分：在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞U87-MG上,采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察Panx-1蛋白的表達(dá)與分布；采用siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)U87-MG中Panx-1的表達(dá),脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)及腺嘌呤核苷三磷酸(Inositol 1,4,5-trisphosphate, ATP)干預(yù)U87-MG, Real-time PCR及Western Blot檢測(cè)Panx-1表達(dá)水平,酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)及液相蛋白懸浮芯片(Bio-Plex(?) suspension array system)同步測(cè)定細(xì)胞外液中細(xì)胞因子(IL-1p、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α)水平,高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)細(xì)胞外液中谷氨酸濃度的變化。第二部分：在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞U87-MG上,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell counting kit-8,CCK-8)檢測(cè)Panx-1-siRNA轉(zhuǎn)染后U87-MG細(xì)胞增殖能力的改變。結(jié)果第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.U87-MG上可見(jiàn)Panx-1蛋白表達(dá),陽(yáng)性顆粒多見(jiàn)于細(xì)胞漿內(nèi),并高表達(dá)于核分裂象細(xì)胞。2.與無(wú)效序列轉(zhuǎn)染組比較,Panx-1-siRNA轉(zhuǎn)染后,Panx-1在mRNA及蛋白水平表達(dá)均下降(P0.05)。同時(shí),細(xì)胞外液中IL-6、IL-8及谷氨酸濃度降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；另外細(xì)胞外液中IL-1β濃度亦降低,但未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3. LPS及ATP處理U87-MG后Panx-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,同時(shí)細(xì)胞外液中IL-1β、IL-6、IL-8及谷氨酸濃度亦無(wú)明顯改變(P0.05)。第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與無(wú)效序列轉(zhuǎn)染組比較,Panx-1蛋白表達(dá)下調(diào)后,反映細(xì)胞增殖能力的標(biāo)志物增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)蛋白水平同步降低,同時(shí)Panx-1-siRNA轉(zhuǎn)染后U87-MG增殖能力顯著下降(P0.01)。結(jié)論1. Panx-1表達(dá)下調(diào)后,U87-MG細(xì)胞外液中IL-6、IL-8及谷氨酸濃度降低,提示Panx-1參與了U87-MG對(duì)細(xì)胞因子IL-6、IL-8及興奮性氨基酸谷氨酸的釋放。2. Panx-1表達(dá)下調(diào)后,U87-MG增殖能力下降,提示Panx-1參與了U87-MG的增殖。
[Abstract]:The effect of Pannexin - 1 on the release of cytokines and glutamic acid from astrocytes is the most important glial cell in the central nervous system . It has been found that Panx - 1 plays an important role in the physiological and pathological processes such as cell signaling , cell proliferation and differentiation , immune inflammation and hypoxic injury .
The expression of Panx - 1 in U87 - MG was downregulated by siRNA cell transfection . The changes of cell proliferation ability of U87 - MG cells transfected with Panx - 1 - siRNA were detected by using cell counting kit - 8 and CCK - 8 .
In addition , the concentration of IL - 1尾 in the extracellular fluid decreased , but there was no statistical difference ( P0.05 ) . There was no significant change in the expression of IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 8 and glutamic acid in the extracellular fluid ( P0.05 ) . The levels of IL - 6 , IL - 8 and glutamate in U87 - MG cells decreased after downregulation of Panx - 1 , suggesting that Panx - 1 was involved in the release of cytokines IL - 6 , IL - 8 and excitatory amino acid glutamic acid . After downregulation of Panx - 1 , the proliferative ability of U87 - MG decreased , suggesting that Panx - 1 was involved in the proliferation of U87 - MG .
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R741

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2129759