發(fā)布時(shí)間：2018-06-29 03:33

  本文選題：凋亡誘導(dǎo)因子 + 程序性壞死�。� 參考：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景:膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性腦部惡性腫瘤,并且具有較高的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率[1]。膠質(zhì)瘤多采用手術(shù)切除聯(lián)合化療和(或)放療的綜合治療,然而現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡出現(xiàn)了一定程度的耐受[2],因此需要尋找一種不通過誘導(dǎo)凋亡而殺死膠質(zhì)細(xì)胞的替代方案。以前的報(bào)道顯示,壞死是一種被動(dòng)的、不受控制的細(xì)胞死亡形式,但是越來越多的證據(jù)表明,壞死也可以通過復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和執(zhí)行機(jī)制而被調(diào)控[3],這種可被控制的壞死稱為“程序性壞死”[3-4]。程序性壞死參與人的生理和病理過程,例如胚胎發(fā)育、缺血性疾病[5]。現(xiàn)在,許多腫瘤細(xì)胞對(duì)通過誘導(dǎo)凋亡的治療產(chǎn)生了一定程度的耐受,因此可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性壞死作為一種有效治療癌癥的策略。天然或者合成化學(xué)藥品如紫草素,β-拉帕醌和索拉菲尼均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死[6-8]。然而,在如何誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性壞死方面我們的了解仍然是匱乏的。扁塑藤素是一種天然三萜系化合物(quinonemethide如圖1所示),從衛(wèi)矛科(Celastraceae)和翅子藤科(Hippocrateaceae)家族的各類植物中分離出來[9]。扁塑藤素通過引起線粒體功能的紊亂誘導(dǎo)多種腫瘤如卵巢癌,肝細(xì)胞癌,宮頸癌,乳腺癌和膠質(zhì)瘤等發(fā)生caspase依賴的凋亡[9-13]。而且,以前的研究顯示線粒體不僅僅參與調(diào)控細(xì)胞凋亡,也在程序性壞死的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-16]。因此,我們推測(cè)扁塑藤素可能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死。我們用膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和移植瘤鼠模型驗(yàn)證扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡是否通過壞死通路,并探討它的潛在作用機(jī)制。目的:用膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和移植瘤的鼠模型驗(yàn)證扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡是否通過壞死通路,并探討它的潛在作用機(jī)制。方法:1、MTT法檢測(cè)扁塑藤素時(shí)間和劑量梯度對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率的影響。2、流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC和PI雙染)、熒光顯微鏡、DNA瓊脂糖凝膠電泳以及透射電鏡檢測(cè)扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡方式及形態(tài)學(xué)變化。3、流式細(xì)胞術(shù)(Rhodamine 123染色)檢測(cè)扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體膜電位變化、Western Blotting法檢測(cè)扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、AIF、Caspase3蛋白表達(dá)水平影響。4、si RNA沉默AIF基因檢測(cè)AIF在扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞殺傷中的作用。5、MTT、流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC和PI雙染)檢測(cè)JNK抑制劑SP600125和si RNA沉默JNK基因?qū)Ρ馑芴偎貙?dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率的影響,流式細(xì)胞術(shù)(Rhodamine 123染色)檢測(cè)JNK抑制劑SP600125對(duì)扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體膜電位變化、Western Blotting法檢測(cè)JNK抑制劑SP600125和si RNA沉默JNK基因?qū)Ρ馑芴偎卣T導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。6、裸鼠皮下移植膠質(zhì)瘤模型檢測(cè)扁塑藤素導(dǎo)致體內(nèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率的影響及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。7、DCFH-DA探針裝載觀察扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及抗氧化劑NAC預(yù)處理對(duì)扁塑藤素導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率、ROS水平及相關(guān)蛋白的影響。通過Mito SOX red染色檢測(cè)扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)超氧化物水平的變化。熒光定量分析(GSH檢測(cè)試劑盒)檢測(cè)扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)GSH水平的變化。結(jié)果:1、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值率顯示:扁塑藤素能夠抑制C6、U251和U87細(xì)胞的增殖活性,并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。2、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:隨著扁塑藤素作用時(shí)間的延長(zhǎng),膠質(zhì)瘤細(xì)胞晚期凋亡和壞死象限的比率明顯地增加。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)扁塑藤素處理后細(xì)胞的細(xì)胞核能被PI染色(紅色),但沒有核凝結(jié)或片段化出現(xiàn)。瓊脂糖凝膠電泳顯示用扁塑藤素處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的DNA電泳呈現(xiàn)模糊的“涂片狀”。透射電鏡結(jié)果顯示:扁塑藤素處理的細(xì)胞出現(xiàn)了染色質(zhì)溶解,低電子密度,質(zhì)膜破裂和完整核膜。3、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:隨著扁塑藤素作用時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞線粒體膜電位水平逐漸下降。Western blotting結(jié)果顯示:隨著扁塑藤素作用時(shí)間延長(zhǎng),胞漿內(nèi)Bax、AIF以及胞核內(nèi)AIF蛋白水平逐漸增高,胞漿內(nèi)Bcl-2蛋白水平逐漸降低。4、si RNA沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞AIF基因后,能降低扁塑藤素引起的腫瘤細(xì)胞死亡(MTT法、流式細(xì)胞術(shù)),Western blot結(jié)果顯示:與單加扁塑藤素組相比,經(jīng)過si RNA沉默AIF基因的扁塑藤素組的細(xì)胞胞漿、胞核內(nèi)AIF蛋白表達(dá)均降低。5、應(yīng)用JNK抑制劑SB600125或si RNA沉默JNK基因,均能抑制扁塑藤素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡(MTT法、流式細(xì)胞術(shù)),與單純扁塑藤素處理組相比,經(jīng)JNK抑制劑SB600125或si RNA沉默JNK基因預(yù)處理的扁塑藤素組胞漿內(nèi)Bax、JNK、p-JNK、AIF以及胞核內(nèi)AIF蛋白水平下降,胞漿內(nèi)Bcl-2水平增高。6、裸鼠皮下移植膠質(zhì)瘤模型結(jié)果顯示:相比生理鹽水處理組,隨著扁塑藤素作用時(shí)間的延長(zhǎng)和作用濃度的增高,扁塑藤素處理組移植瘤的體積和重量逐漸減小和減輕。胞漿內(nèi)Bax、JNK、p-JNK、AIF以及胞核內(nèi)AIF蛋白水平增高,胞漿內(nèi)Bcl-2水平降低,結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)相一致。7、熒光顯微鏡觀察DCFH-DA探針裝載的扁塑藤素誘導(dǎo)C6和SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,經(jīng)扁塑藤素處理后膠質(zhì)瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。抗氧化劑NAC預(yù)處理后,相比扁塑藤素單獨(dú)處理組,NAC預(yù)處理抑制了扁塑藤素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存率下降、線粒體膜電位升高以及胞漿內(nèi)Bax、JNK、p-JNK、AIF以及胞核內(nèi)AIF蛋白水平下降,胞漿內(nèi)Bcl-2水平增高。Mito SOX紅色熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示扁塑藤素作用膠質(zhì)瘤細(xì)胞后線粒體內(nèi)的超氧化物(ROS的一個(gè)成員)明顯增加。熒光定量法檢測(cè)GSH結(jié)果顯示:GSH水平下降與扁塑藤素作用時(shí)間梯度呈正相關(guān)。結(jié)論:1、扁塑藤素能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞AIF依賴的程序性壞死。2、扁塑藤素通過JNK的激活誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞AIF依賴的程序性壞死。3、扁塑藤素通過線粒體中ROS的過度產(chǎn)生導(dǎo)致JNK的活化誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的程序性壞死。
[Abstract]:BACKGROUND : Gliomas are the most common primary malignant tumors of the brain , and have a higher incidence and recurrence rate . glioma cells are treated with chemotherapy and / or radiotherapy combined with surgical resection . However , glioma cells have a certain level of tolerance to apoptosis induced by radiotherapy and chemotherapy . Previous reports suggest that necrosis is a passive , uncontrolled cell death , but a growing number of evidence suggests that necrosis can also be regulated by complex signaling pathways and execution mechanisms , which can be controlled as " procedural necrosis " , which involves the physiological and pathological processes of human , such as embryonic development and ischemic disease . Now , many tumor cells have a certain level of tolerance to the treatment of apoptosis through induction of apoptosis . It is therefore possible to induce apoptosis in tumor cells by inducing apoptosis in tumor cells . Natural or synthetic chemicals such as shikonin , beta - lapatone , and sordid can induce a programmed necrosis of tumor cells . However , our knowledge is still deficient in how to induce apoptosis in tumor cells . The apoptosis of glioma cells was studied by MTT , flow cytometry and transmission electron microscope . In comparison with control group , the expression of Bcl - 2 protein in human glioma cells decreased . The results of Western blotting showed that the expression of Bcl - 2 protein decreased and the level of Bcl - 2 protein decreased . Conclusion : 1 . The results of fluorescence quantitative analysis showed that the level of GSH decreased significantly . The results showed that the level of GSH decreased significantly in the cytoplasm of glioma cells . Conclusion : 1 . Conclusion : 1 . The results showed that the level of GSH decreased significantly .
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：2080662