本文選題：IKBKE + 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的在我們的研究中,我們驗(yàn)證IKBKE在多種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中過度表達(dá),并且可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。同時(shí),我們驗(yàn)證IKBKE能夠通過增強(qiáng)YAP1和TEAD2的表達(dá)而促進(jìn)EMT。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們驗(yàn)證沉默IKBKE能夠抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展。方法我們選擇U87-MG細(xì)胞系和LN-229細(xì)胞系作為典型的細(xì)胞系用于研究。應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)來評(píng)估沉默IKBKE組和對(duì)照組細(xì)胞之間不同的增殖能力。我們采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,應(yīng)用transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。為進(jìn)一步闡明實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)機(jī)制,我們通過real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)評(píng)估MMP2和MMP9的蛋白含量變化。我們應(yīng)用real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析IKBKE的表達(dá)水平能否影響EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)。我們過表達(dá)IKBKE進(jìn)一步檢測(cè)了YAP1,TEAD2及EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)量,并完善IKBKE和YAP1及TEAD2之間相互作用關(guān)系的研究。為進(jìn)一步探索Hippo信號(hào)通路是否能夠影響惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),我們轉(zhuǎn)染siRNA分別下調(diào)細(xì)胞中YAP1和TEAD2的表達(dá)量。下調(diào)YAP1后,我們應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了E-cadherin和vimentin的蛋白含量,real-time RT-PCR結(jié)果檢測(cè)它們的mRNA表達(dá)量。與此同時(shí),下調(diào)TEAD2表達(dá)后我們應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)揭示N-cadherin、β-catenin和vimentin的蛋白含量,real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)它們的mRNA表達(dá)量。此外我們?cè)谵D(zhuǎn)染IKBKE-shRNA的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中分別過表達(dá)YAP1和TEAD2,并檢測(cè)了與沉默YAP1/TEAD2實(shí)驗(yàn)相同的EMT標(biāo)志蛋白。我們進(jìn)一步完善體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了U87-MG的成瘤作用。首先裸鼠皮下種植對(duì)照組U87-MG細(xì)胞和沉默IKBKE的U87-MG細(xì)胞種植。接下來,我們分別將U87-MG對(duì)照組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染IKBKE-shRNA的U87-MG實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞原位種植于裸鼠顱內(nèi),并通過免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞中IKBKE、YAP1、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、vimentin和snail指標(biāo)進(jìn)行染色比較。結(jié)果CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默IKBKE后U87-MG和LN-229細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制;同時(shí)與對(duì)照組細(xì)胞相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈現(xiàn)出克隆形成能力降低和更小的克隆細(xì)胞團(tuán)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默IKBKE抑制細(xì)胞劃痕愈合率。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染IKBKE-shRNA后穿膜的細(xì)胞平均數(shù)明顯減少。沉默IKBKE后細(xì)胞中MMP-2和MMP-9在mRNA和蛋白水平上明顯降低。沉默IKBKE腫瘤細(xì)胞中的上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin含量增高,間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin、vimentin、Snail、Slug和twist含量降低。同時(shí)沉默IKBKE后YAP1和TEAD2的表達(dá)量也明顯降低。過表達(dá)IKBKE后,上述蛋白的表達(dá)量與沉默IKBKE實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。沉默IKBKE和過表達(dá)IKBKE后,YAP1和TEAD2的mRNA含量無明顯變化。同時(shí)IKBKE與YAP1和TEAD2存在直接作用關(guān)系。下調(diào)YAP1的U87-MG和LN-229細(xì)胞中,vimentin的表達(dá)降低,而E-cadherin的表達(dá)增高。此外,下調(diào)TEAD2表達(dá)后,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中N-cadherin,β-catenin和vimentin的表達(dá)減少。E-cadherin的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染IKBKE-shRNA后首先增高,而繼續(xù)過表達(dá)YAP1后,其表達(dá)量降低。然而vimentind表達(dá)量的變化趨勢(shì)與E-cadherin表達(dá)量變化趨勢(shì)相反。同樣,在轉(zhuǎn)染IKBKE-shRNA的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,過表達(dá)TEAD2后N-cadherin,β-catenin和vimentin的表達(dá)量恢復(fù)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組裸鼠的腫瘤大小、腫瘤生長(zhǎng)率和腫瘤重量比沉默IKBKE實(shí)驗(yàn)組明顯增加,即轉(zhuǎn)染IKBKE-shRNA后所形成的顱內(nèi)腫瘤體積明顯減小,同時(shí)下調(diào)IKBKE與裸鼠生長(zhǎng)率的增加和體重丟失量的減少相關(guān)。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)組腫瘤的E-cadherin表達(dá)量增高,MMP-2、MMP-9、N-cadherin、β-catenin、vimentin和snail的表達(dá)量降低。結(jié)論沉默IKBKE可以抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。IKBKE促進(jìn)細(xì)胞的EMT過程,同時(shí)IKBKE能夠通過抑制Hippo信號(hào)通路而誘導(dǎo)YAP1和TEAD2的表達(dá)量增多。此外,YAP1和TEAD2也可以促進(jìn)EMT過程。然而IKBKE與YAP1和TEAD2存在直接相互作用。上述結(jié)果表明,IKBKE能夠通過影響Hippo信號(hào)通路促進(jìn)EMT過程。在裸鼠皮下和顱內(nèi)腫瘤模型中,沉默IKBKE可以抑制惡性膠質(zhì)瘤的成瘤性。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of IKBKE in human glioma cell lines by means of real - time RT - PCR , Western blot and Western blot . Conclusion : IKBKE can inhibit the proliferation , migration and invasion of malignant glioma cells . The results show that IKBKE can inhibit the proliferation , migration and invasion ability of malignant glioma cells .
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2051795