本文選題：parkin基因 + 突變�。� 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景帕金森病(Parkinson’s disease,PD)又名震顫麻痹,由英國醫(yī)師James.Parkinson在1817年首先描述,是一種常見于中老年的慢性進展性神經(jīng)系統(tǒng)變性病,隨著人類壽命的不斷延長,人口老齡化日益突出,PD發(fā)病率逐年增加,成為危害中老年健康的重要疾病。PD的主要臨床表現(xiàn)是姿勢反射障礙、運動遲緩,肌張力增高及靜止性震顫。PD是中老年人常見的疾病,多發(fā)生在60歲以上人群,此后隨著年齡的增加其發(fā)病率逐漸增加。據(jù)統(tǒng)計65歲以上人群患病率為1000/10萬。但有一部分患者發(fā)病年齡偏小,發(fā)病年齡小于40歲,Quinn等學(xué)者定義為“早發(fā)型帕金森病(Early-Onset Parkinson’s Disease,EOPD)”,約占PD的4-10%,日本學(xué)者報道約為18.4%,以往研究多認為EOPD有家族聚集性,與LOPD(Late-Onset Parkinson’s Disease,LOPD)相比,其發(fā)病率、臨床表現(xiàn)及預(yù)后均有不同。Mc Dermott等將48例EOPD與123例LOPD患者進行對照研究,發(fā)現(xiàn)EOPD患者多表現(xiàn)震顫(Tremor-Dominant,TD),而LOPD患者更多表現(xiàn)運動遲緩-強直(Postural Instability and Gait Disturbance,PIGD),EOPD患者對左旋多巴的反應(yīng)性較好,但更容易出現(xiàn)運動障礙和劑末現(xiàn)象。此外,EOPD疾病進展較慢,肌張力障礙和左旋多巴誘發(fā)性運動障礙發(fā)生率更高,較少出現(xiàn)運動和認知障礙。但是目前對EOPD的臨床特征仍存在爭議,尚不清楚是否存在地域差異。PD的發(fā)病機制目前尚未闡明,目前的研究表明與遺傳、環(huán)境因素、感染、衰老、氧化應(yīng)激、自由基損傷及神經(jīng)生長因子缺乏等有相關(guān)性,可能是多種機制協(xié)同作用的結(jié)果。在眾多的學(xué)說中,遺傳因素?zé)o疑是研究最多的,通過對家族性PD相關(guān)基因的研究,已發(fā)現(xiàn)24個基因位點與PD的發(fā)病有關(guān),分別是PARK1-16、EIF4G1、GBA、DOCTN1、POLG1、GCH1、TH、SLC6A3及ATXN2等,其中PARK2基因即Parkin基因的研究較多。該基因于1997年首次在日本的常染色體隱性遺傳的EOPD家系中被發(fā)現(xiàn)。此后的研究表明,無論家族性或散發(fā)性帕金森病Parkin基因在PD的遺傳性機制中都起到重要作用。該基因定位于6q25.2-q27,位于遺傳標(biāo)記D6S305和D6S253之間,有12個外顯子,全長約為1.5Mb,編碼序列為1395bp,開放閱讀框架編碼465氨基酸的產(chǎn)物。Parkin基因突變是所有已知的隱性遺傳性PD中最常見的原因,突變類型有缺失、錯義突變、無義突變和外顯子的多倍體等。在EOPD患者中,Parkin基因突變的頻率在家族性PD中高達50%,遺傳性Parkin基因的突變具有明顯的多樣性,該基因12個外顯子均有不同程度的序列改變,其中以4、6、7最為常見,它們都處于突變的熱點區(qū)域。有研究者對來自5個國家的12個常染色體隱性遺傳的青少年型帕金森綜合征家系進行篩查,探討Parkin基因外顯子的缺失與表型的關(guān)系,認為不同的家系可能有不同的外顯子的缺失,從而產(chǎn)生不同的表型特征,這可能與外顯子的功能分工有關(guān)。目前,國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些Parkin基因突變都只能解釋部分家族性PD的發(fā)病原因,且在不同人群中突變的性質(zhì)和部位也有不同,這說明不同人種及地域的PD病人可能存在不同的Parkin基因突變。新疆維吾爾自治區(qū)地處中國西北邊陲,占全國面積1/6,人口2000余萬,生活著漢族、維吾爾族、哈薩克族和蒙古族等多個不同民族。遺傳基因、文化傳統(tǒng)、風(fēng)俗習(xí)慣和生活方式、地理條件、經(jīng)濟發(fā)展?fàn)顩r等與內(nèi)地均存在巨大的差異。維吾爾族是新疆的第一大民族,是公元前三世紀(jì)游牧于我國北方和西北貝加爾湖以南、額爾齊斯河和巴爾喀什湖之間的“丁零”人,并逐漸融合了突厥和漢族人,因此與漢族有著明顯的區(qū)別。隨著人口老齡化加劇,新疆維吾爾族PD患者也隨著增加。目前我國僅有關(guān)于漢族家族性PD患者的Parkin基因的突變及多態(tài)性分析的研究報道,缺乏維吾爾族家族性PD的相關(guān)資料。Parkin基因的突變是否與新疆維吾爾族家族性PD患者的發(fā)病相關(guān),其Parkin基因是否與漢族或世界其他種族不同,值得我們進一步研究。了解維吾爾族家族性PD的Parkin基因特征、探討不同民族家族性PD的差異及其影響因素,特別是PD的分子生物學(xué)特征對于PD的發(fā)病機制及預(yù)防策略研究具有十分重要的意義。目的1)研究和發(fā)現(xiàn)EOPD的臨床特征,為臨床診斷和治療提供參考依據(jù)。2)探討維吾爾族早發(fā)型家族性PD患者的Parkin基因突變特點,為進一步研究其發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。方法第一部分:采用病例-對照的研究方法。納入2011年1月-2013年12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院就診的(門診及病房)PD患者。采用英國腦庫PD診斷標(biāo)準(zhǔn)進行診斷:運動減少,肌肉僵直,靜止性震顫,姿勢不穩(wěn),單側(cè)起病,進行性加重,對左旋多巴治療反應(yīng)好等。排除診斷:反復(fù)的腦損傷史;反復(fù)的腦卒中發(fā)作史;明確的非藥物所致動眼危象以及/或者腦炎史;接觸已知的神經(jīng)毒類物質(zhì);用大劑量左旋多巴治療無效;存在其他類型的神經(jīng)系統(tǒng)病變或體征,例如共濟失調(diào),早期嚴(yán)重癡呆并伴有言語功能及記憶力功能等障礙,早期嚴(yán)重自主神經(jīng)功能受損,陽性的錐體束征者等。根據(jù)1987年Quinn等的標(biāo)準(zhǔn),將PD患者分成EOPD和LOPD兩組。根據(jù)HoehnYahr分期將PD患者分成HoehnYahr 1-2.5期(H-Y早期)和HoehnYahr3-5期(H-Y中晚期)兩組。收集PD患者臨床資料包括病史、神經(jīng)系統(tǒng)�？企w征、血液常規(guī)檢查、頭顱磁共振(Magnetic Resonance Imaging,MRI)檢查、統(tǒng)一帕金森病評分量表(Unified Parkinson Diease Rrating Scale,UPDRS)評分、HoehnYahr分期、Zung焦慮自評量表(Zung Self-Rating Anxiety Scale,SAS),Zung抑郁自評量表(Zung Self-Rating Depression Scale,SDS)及蒙特利爾認知評估量表(the Montreal Cognitive Assessment,Mo CA)量表等。比較早發(fā)型及晚發(fā)型PD患者的一般資料、臨床表現(xiàn)、HoehnYahr評分、UPDRS評分、Mo CA量表評分、Zung焦慮抑郁量表、對左旋多巴反應(yīng)及臨床類型等。比較H-Y早期和H-Y中晚期兩組PD患者的臨床資料及上述評分,通過多因素Logistic回歸分析的方法,分析影響病情嚴(yán)重程度的相關(guān)因素。第二部分:對一長期居住于新疆托克遜縣的PD家系進行調(diào)查,根據(jù)英國腦庫診斷標(biāo)準(zhǔn),該家系3代15個成員中3例確診為PD,男性2例,女性1例,發(fā)病年齡均小于40歲,余12例目前尚無PD癥狀。采集10例家系成員的外周血,利用血液DNA提取試劑盒提取基因組DNA,根據(jù)特異性的引物序列及擴增條件擴增Parkin基因第3-7個外顯子。PCR擴增條件為變性95℃2min,退火溫度55℃30s,延伸72℃30s,再變性95℃20s共34循環(huán),終產(chǎn)物再55℃30s變性,72℃延長7min.產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳證實擴增產(chǎn)物后送去DNA測序。通過測序技術(shù)分析該維吾爾族家系的Parkin基因突變情況,探討Parkin基因突變與維吾爾族EOPD的相關(guān)性。第三部分:于2014年1月采用入戶現(xiàn)場調(diào)查方法,對上述EOPD家系進行隨訪調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括一般資料、臨床癥狀、神經(jīng)系統(tǒng)�？企w征、UPDRS評分、HoehnYahr評分、焦慮抑郁量表及Mo CA量表等。并對有陽性體征者與2012年5月的調(diào)查進行比較,了解PD患者臨床癥狀進展等情況。該研究經(jīng)過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員的批準(zhǔn),所有參與者均簽署知情同意書。結(jié)果第一部分:該研究共納入160例PD患者,其中EOPD患者30例,LOPD患者130例。EOPD患者中男性10例,女性20例,年齡39.10±5.74歲,發(fā)病年齡35.33±4.19歲,病程3.77±2.45年,漢族17例,維吾爾族13例,有家族史的3例;LOPD患者130例,男性90例,女性40例,年齡70.44±7.11歲,發(fā)病年齡63.71±6.10歲,病程6.74±3.32年,漢族80例,維吾爾族50例,有家族史的2例。與LOPD相比,EOPD首發(fā)癥狀以震顫為主16例,占53.3%,而LOPD則以強直為主,為85例占65.20%(p=0.001);HoehnYahr評分中EOPD以H-Y早期為主20例,占66.7%,而LOPD以H-Y中晚期為主85例,占65.39%(p=0.01);UPDRS評分中LOPD患者更高,運動障礙更重,生活能力更差(p=0.000);EOPD對左旋多巴反應(yīng)有效率高于LOPD,而LOPD對左旋多巴無效及不耐受表現(xiàn)更明顯(p=0.03);在PD臨床類型方面,EOPD以TD型為主,而LOPD多表現(xiàn)PIGD型(p=0.01);在頭顱MRI檢查中EOPD基本表現(xiàn)正常,而LOPD患者有68例(52.3%)表現(xiàn)異常,主要表現(xiàn)腦萎縮、輕度腦白質(zhì)變性等(p=0.000)。但SAS、SDS和Mo CA評分兩組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。比較H-Y早期和H-Y中晚期兩組PD患者的臨床資料及上述評分,通過多因素Logistic回歸分析的方法,分析影響病情嚴(yán)重程度的相關(guān)因素,結(jié)果發(fā)現(xiàn),年齡(OR=1.605,95%CI 1.255-2.051,p=0.000)、發(fā)病年齡(OR=1.242,95%CI1.137-1.356,p=0.000)、病程(OR=1.253,95%CI 1.757-1.906,p=0.000)、首發(fā)癥狀(OR=1.108,95%CI 0.768-1.413,p=0.016)、EOPD/LOPD(OR=1.016,95%CI0.997-1.035,p=0.001)與病情嚴(yán)重程度有相關(guān)性。第二部分:調(diào)查維吾爾族PD家系共3代15人,PD遺傳模式呈常染色體隱性遺傳,從10例家庭成員中采集外周血,包括3例PD患者及其直系親屬。3例患者男性2例,女性1例,平均年齡為36.67±2.05歲,平均發(fā)病時間為4.00±0.81年。3例PD患者均為第二代,患者父母及下一代均表型正常,無PD表現(xiàn)。3例PD患者均為40以前發(fā)病,符合早發(fā)性PD診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中先證者男性,35歲,病史3年,主要表現(xiàn)為右側(cè)肢體靜止性震顫,四肢肌張力增高,行走不穩(wěn),表情僵硬等,頭顱CT及MRI未見異常。血常規(guī)、生化、凝血功能等未見異常。血清銅元素輕度下降,但血清銅藍蛋白、肝臟超聲未見異常,K-F環(huán)陰性,左旋多巴試驗陽性。UPDRS評分27分、HoehnYahr分期1期,維吾爾語版Mo CA量表26分,Zung氏抑郁焦慮量表評分51分,輕度抑郁。先證者一姐姐和哥哥均為PD患者,二者臨床表現(xiàn)與先證者基本相似,對左旋多巴療效良好。根據(jù)特異性引物分別擴增parkin基因第3-7外顯子序列,經(jīng)直接基因測序發(fā)現(xiàn)PD患者及健康家系成員第3-6個外顯子未見突變,第7個外顯子發(fā)現(xiàn)2個突變位點,其中患者6號和8號可見C924T、G951C突變位點,患者9號可見G951C突變。同樣在健康的家系成員中可見1號和12號C924T突變位點,13號G951C的突變位點。我們發(fā)現(xiàn)該家系中60%的(基因測序的10例成員中6例)成員攜帶Parkin基因突變,且均為錯義點突變。其中3例PD患者均攜帶復(fù)合雜合性點突變,而3例正常成員攜帶單個雜合性點突變。我們在該維吾爾族家系中共發(fā)現(xiàn)了兩個點突變,即G951C(G284R)和C924T(R275W),均位于parkin基因第七個外顯子。錯義點突變G951C(G284R)是因Parkin基因951為堿基G變?yōu)镃,從而導(dǎo)致Gly替換為Arg。同時我們在該家系中還檢測到在歐洲PD患者中常見的突變位點,即C924T(R275W),同樣位于Parkin基因第7個外顯子,由Parkin基因924位堿基由C變?yōu)門,導(dǎo)致氨基酸Arg替換為Trp。該位點是EOPD常見的突變位點。本研究中發(fā)現(xiàn)3例PD患者除該突變位點外,合并G951C(G284R)突變,即存在復(fù)合型點突變。而3例正常成員僅存在當(dāng)個C924T R275W)或G951C(G284R)突變。第三部分:我們對該家系進行2年的隨訪,15例成員中仍只有3例PD患者(6、7、9號成員),均為第二代,患者父母及下一代均表型正常,無PD表現(xiàn)。6號成員開期及關(guān)期檢查神經(jīng)系統(tǒng)陽性體征均有加重,主要表現(xiàn)肌張力增高及震顫加重;8號成員開期及關(guān)期檢查,軀干肌肌張力較2年前明顯增高。9號成員開期及關(guān)期檢查,較2年前肌張力及震顫均有加重。UPDRS評分、HoehnYahr評分、焦慮抑郁量表及Mo CA量表在開期及關(guān)期均有不同程度的加重。結(jié)論在本組資料中EOPD約占18.75%,接近于日本報道水平(18.4%),高于國內(nèi)其他報道。與以往報道的結(jié)論一致,與LOPD比較,LOPD的臨床特征是首發(fā)癥狀為震顫、H-Y早期多見,UPDRS評分低,對左旋多巴反應(yīng)良好,臨床分型TD型多見,頭MRI正常,但未發(fā)現(xiàn)SAS、SDS與Mo CA評分的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究進一步發(fā)現(xiàn)EOPD是PD疾病嚴(yán)重程度輕的獨立預(yù)測因子。本研究首次發(fā)現(xiàn)Parkin基因第7個外顯子復(fù)合雜合性點突變G951C(G284R)和C924T(R275W)突變與維吾爾族早發(fā)型家族性PD的相關(guān)。2年隨訪調(diào)查提示,PD患者臨床癥狀都有不同程度的加重,神經(jīng)心理方面加重的更為明顯。在運動障礙方面,主要是運動及步行遲緩、震顫加重較明顯。認知功能方面無明顯變化。異動癥的發(fā)生明顯增加。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

【參考文獻】

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本文編號：2029010