發(fā)布時間：2018-06-15 23:28

  本文選題：膠質(zhì)瘤 + 衰老��； 參考：《山東大學》2014年博士論文

【摘要】：目的 膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤。WHO分為I-IV級,其中Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤可占所有膠質(zhì)瘤的77.5%。通常WHO Ⅲ級膠質(zhì)瘤的中位生存期2-3年,膠質(zhì)母細胞瘤(WHO Ⅳ級)中位生存期僅1年。膠質(zhì)瘤的預后取決于多種因素和診治措施,雖然目前惡性膠質(zhì)瘤的治療采用手術(shù)治療、放療、化療等多種療法的綜合治療,但仍有相當多的患者在1年內(nèi)復發(fā)。由于膠質(zhì)瘤生長的特殊部位,使得手術(shù)徹底切除具有相當大的難度,并且極易產(chǎn)生后遺癥,降低生活質(zhì)量。雖然以替莫唑胺為代表的新型化療藥物提高了膠質(zhì)瘤的化療療效,但是由于血腦屏障的存在,化療的效果極其有限。放射治療在膠質(zhì)瘤的治療中具有極其重要的地位,術(shù)后放療可以降低膠質(zhì)瘤的復發(fā)率,殺滅或抑制殘余腫瘤細胞,提高治愈機會。對于無法手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤,也能采取放射治療的方法控制腫瘤生長,延長生存期,提高生活質(zhì)量。但由于膠質(zhì)瘤具有抗凋亡和放射抵抗的特點,常使得膠質(zhì)瘤放射治療效果不理想、易于復發(fā)。如何提高膠質(zhì)瘤的放射敏感性,一直是膠質(zhì)瘤治療領域的研究重點之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn),某些膠質(zhì)瘤細胞在接受輻射后,并不發(fā)生細胞凋亡,出現(xiàn)的是細胞衰老現(xiàn)象。細胞衰老是指細胞脫離細胞周期不可逆的停滯于細胞周期的某階段(一般為G0/G1期),細胞仍然存在一些代謝活性,但卻不能再進行增殖,這也是一種重要的腫瘤抑制機制。逃逸衰老效應可能在膠質(zhì)瘤的放射抵抗性中有重要地位。Bmi-1在惡性膠質(zhì)瘤中呈高表達,通過多種信號途徑參與細胞衰老過程,可能是腫瘤細胞逃逸衰老、抗凋亡效應和放化療抵抗性的關鍵基因之一。研究Bmi。1與膠質(zhì)瘤特別是高級別膠質(zhì)瘤輻射抵抗性之間的關系,不僅具有生物學基礎理論研究上的意義,亦具有重要的臨床意義。MicroRNA-128a在正常腦組織中含量豐富,表達水平在膠質(zhì)瘤組織樣本中顯著下調(diào),并且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖能力及神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新能力相關。MicroRNA-128a能抑制Bmi-1表達,進而影響其作為癌基因所發(fā)揮的表觀遺傳調(diào)節(jié),促進細胞增殖和干細胞自我更新等生物學功能。在本研究中,我們選用了人膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87MG,進行了這項研究,驗證膠質(zhì)瘤的輻射抵抗性及抗凋亡能力,輻射后細胞衰老的發(fā)生,以及輻射對Bmi-1及MicroRNA-128a表達的影響,探索通過調(diào)節(jié)MicroRNA-128a的表達來調(diào)控Bmi-1的表達,是否有可能改變膠質(zhì)瘤細胞的放射敏感性。以期為MicroRNA-128a及Bmi-1作為膠質(zhì)瘤放射增敏新靶點的科學研究提供參考。材料與方法 1.人膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U87MG購自中國科學院細胞庫,利用常規(guī)細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)、傳代、凍存、復蘇。 2.培養(yǎng)U87MG膠質(zhì)瘤細胞,利用直線加速器對實驗用細胞進行放射干預。采用源皮距照射技術(shù),將放射相關參數(shù)及所需放射劑量及分割方式報告給有經(jīng)驗的物理師并設計放射計劃,在實驗前對放射計劃進行精確的劑量驗證。 3.給予不同劑量的X射線干預U87MG細胞后,采用PI-Annexin V FITC雙染色標記U87MG細胞,流式細胞術(shù)進行細胞凋亡檢測。 4.給予不同劑量的X射線干預U87MG細胞。衰老細胞通常體積變大,表達pH6.0時有高酶活性的p-半乳糖苷酶。故采用p-半乳糖苷酶染色進行細胞衰老的檢測。 5.給予不同劑量的X射線干預U87MG細胞后,將待測細胞提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度后,利用蛋白免疫印跡方法進行Bmi-1蛋白表達檢測。 6.給予不同劑量的X射線干預U87MG細胞后,提取總RNA純化后進行RNA質(zhì)量檢驗和純度測定。樣品檢驗合格后,采用實時定量PCR方法進行Bmi-1mRNA及MicroRNA-128a表達的檢測。 7.給予不同劑量的X射線干預U87MG細胞后,采用熒光探針DCFH-DA標記細胞,利用流式細胞術(shù)檢測2',7'-二氯熒光黃的熒光,評估細胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果 1.從細胞生長曲線可以看出,各組細胞均呈現(xiàn)對數(shù)增殖趨勢,X線輻射后均未出現(xiàn)明顯的細胞數(shù)量減少。其中1Gy、2Gy組增殖總趨勢與對照組無明顯差異。在接受輻射后的24h,1Gy、2Gy組增殖較對照組增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4Gy、6Gy、8Gy組在輻射后72h較對照組出現(xiàn)明顯的增殖減緩趨勢,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。這表明U87MG細胞存在一定的輻射抵抗性。 2.從結(jié)果抑制率曲線可以明顯看出,1Gy、2Gy組在接受輻射后的5d內(nèi)呈現(xiàn)明顯的刺激增殖效應,其結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；在輻射后第7天呈現(xiàn)出20%左右的抑制率。6Gy、8Gy組可以觀察到X射線對U87MG膠質(zhì)瘤細胞生長具有明顯的抑制作用,抑制率隨輻射后時間而增加,與輻射劑量成正相關,其結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。所有組別細胞在輻射后第7天均呈現(xiàn)明顯的抑制效應,其抑制率平均值如下：1Gy組20.35%、2Gy組20.53%、4Gy組48.8%、6Gy組68.51%、8Gy組83.15%,其效應強度與輻射劑量有相關性,說明X射線對U87MG細胞的增殖具有抑制效應。 3.不同劑量X線輻射后72h,各組細胞均未出現(xiàn)明顯的細胞凋亡。說明X射線不能誘導U87MG膠質(zhì)瘤細胞凋亡,其輻射抑制效應可能不是通過細胞凋亡機制實現(xiàn)的,應該有其他細胞抑制機制的存在。 4.不同劑量輻射后,在相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化,可以觀察到衰老細胞體積明顯變大,細胞扁平度增加,細胞核增大、染色深、核內(nèi)可見顆粒狀包含物。β-半乳糖苷酶染色檢測衰老細胞的比例與輻射強度呈正相關,各組衰老細胞比例與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。這表明X射線對U87MG膠質(zhì)瘤細胞的抑制效應是通過促進細胞衰老實現(xiàn)的。 5.X線輻射后24小時,1Gy、2Gy組S期細胞比例較對照組明顯增加,說明細胞在低劑量輻射的刺激下,DNA合成增加。各組G0/G1期細胞比例隨放射強度增加而增加,呈正相關性。這也一定程度上說明X射線對U87膠質(zhì)瘤細胞的抑制有細胞衰老機制的參與。輻射后72h,各輻射組細胞S期細胞均較對照組增加,推測可能的原因是輻射導致細胞周期再分布,而晚S期細胞放射不敏感,造成S期細胞比例增加。G2/M期細胞比例呈現(xiàn)隨放射劑量增加而增加的趨勢,在6Gy、8Gy組,出現(xiàn)明顯的G0/G1期細胞比例減少、G2/M期細胞比例增多的現(xiàn)象,可能存在某種機制,使U87MG細胞發(fā)生逃逸衰老的情況,這也是U87MG細胞輻射抵抗性的產(chǎn)生機制之一。 6.輻射后72小時,U87MG膠質(zhì)瘤細胞的Bmi-1的蛋白表達水平和mRNA表達水平在6Gy和8Gy組明顯上調(diào)。說明U87MG細胞逃逸衰老的過程中可能有Bmi-1基因的參與。 7.輻射后72h,8Gy組MicroRNA-128a表達明顯減少,減少程度具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。1Gy、2Gy組MicroRNA-128a表達明顯增加,其增加程度具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 8.輻射后2h,2Gy組較其他組的ROS水平有所增加。輻射后12h,各輻射組ROS水平均較對照組有所增加。應用NAC處理后U87MG膠質(zhì)瘤細胞后,再用8Gy X線處理細胞,發(fā)現(xiàn)X線對U87MG細胞的抑制率明顯降低。結(jié)論 1.U87MG膠質(zhì)瘤細胞具有輻射抵抗性和抗凋亡的特點。 2.X射線可以抑制U87MG膠質(zhì)瘤細胞的生長,與劑量強度具有相關性,其抑制效應是通過細胞衰老實現(xiàn)的。 3.U87MG膠質(zhì)瘤細胞接受輻射后可能存在著逃逸衰老現(xiàn)象,這可能是輻射抵抗性的產(chǎn)生機制之一。 4.ROS是X線輻射殺傷U87MG膠質(zhì)瘤的重要分子之一,降低輻射時產(chǎn)生的ROS水平能增加U87MG膠質(zhì)瘤細胞的輻射抵抗性。 5.Bmi-1可能參與U87MG膠質(zhì)瘤輻射后逃逸衰老的過程并在其中具有重要地位。 6. U87MG膠質(zhì)瘤輻射后Micro128a的表達與劑量強度相關,并有可能參與Bmi-1表達的調(diào)控。
[Abstract]:Purpose

MicroRNA - 128a plays an important role in the treatment of glioma , and it can reduce the recurrence rate of glioma . It can reduce the recurrence rate of glioma . It can reduce the recurrence rate of glioma . It can reduce the recurrence rate of glioma . To investigate the expression of Bmi - 1 by regulating the expression of MicroRNA - 128a , it is possible to alter the radiosensitivity of glioma cells . It is expected to provide references for scientific research on microRNAs - 128a and Bmi - 1 as a new target for radiosensitization of glioma . Materials and Methods

1 . Human Glioblastoma cell line U87MG was purchased from the cell bank of Chinese Academy of Sciences , cultured by conventional cell culture method , passaged , frozen and recovered .

2 . The U87MG glioma cells were cultured , and the experimental cells were radiated with the linear accelerator . The radiation - related parameters and the required radiation dose and division mode were reported to the experienced physical division and the radiation plan was designed by using the source - skin - distance irradiation technique , and the radiation plan was accurately dose - verified before the experiment .

3 . After administration of U87MG cells with different doses of X - rays , the apoptosis of U87MG cells and flow cytometry were detected by PI - annexin - V FITC - labeled U87MG cells .

4 . Different doses of X - ray intervention U87MG cells were administered . The senescence cells usually have a large volume and a high enzyme activity of p - galactosidase when expressed at pH 6.0 . The detection of cell senescence was performed by using p - galactosidase staining .

5 . After administration of U87MG cells with different doses of X - rays , the total protein was extracted from the cells to be detected . After the BCA method was used to determine the protein concentration , the Bmi - 1 protein expression was detected by Western blotting .

6 . After administration of U87MG cells with different doses of X - rays , RNA quality test and purity determination were carried out after the total RNA was purified . After the samples were qualified , the expression of Bmi - 1mRNA and MicroRNA - 128a was detected by real - time quantitative PCR .

7 . After administration of U87MG cells with different doses of X - rays , fluorescent probe DCFH - DA labeled cells were used to detect the fluorescence of 2 ' , 7 ' - dichlorofluorescein by flow cytometry , and the intracellular ROS level was assessed .

1 . From the growth curve of the cells , there was no significant difference in the number of cells in each group . There was no significant difference in the proliferation of X - ray after irradiation . The proliferation of the group was significantly higher than that in the control group at 24h , 1Gy and 2Gy after irradiation .

2 . From the result inhibition curve , it can be seen that 1Gy , 2Gy group exhibited obvious stimulation proliferative effect in 5 days after receiving radiation , and the result was statistically significant ( P0.05 ) .
The inhibitory rate of X - ray on U87MG glioma cells was significantly inhibited after irradiation on the 7th day after radiation . The inhibition rate increased with the time of radiation , and the inhibition rate was significantly correlated with the radiation dose . The average inhibitory rate was as follows : 20.35 % in 1Gy group , 20.53 % in 2Gy group , 48.8 % in 4Gy group , 68.51 % in 6Gy group and 83.15 % in 8Gy group .

3 . Apoptosis of U87MG glioma cells could not be induced by X - ray irradiation at 72 h after X - ray irradiation . It was suggested that X - ray could not induce apoptosis of U87MG glioma cells .

4 . After radiation of different doses , the morphological changes of the cells were observed under the phase contrast microscope . It was observed that the volume of aging cells increased significantly , the cell flattened degree increased , the nucleus increased , the staining was deep , and the granular inclusion bodies were observed in the nucleus . The proportion of 尾 - galactosidase staining was positively correlated with the radiation intensity , and the proportion of aging cells in each group was statistically significant compared with the control group ( P0.05 ) . This suggested that the inhibitory effect of X - ray on U87MG glioma cells was realized by promoting cell senescence .

The percentage of cells in G0 / G1 phase increased with the increase of radiation intensity .

6 . Bmi - 1 protein expression level and mRNA expression level of U87MG glioma cells were up - regulated in 6Gy and 8Gy group 72 hours after irradiation .

7 . The expression of MicroRNA - 128a in 8Gy group was significantly decreased at 72h after radiation ( P0.05 ) . The expression of MicroRNA - 128a in group 1Gy and 2Gy increased significantly ( P0.05 ) .

8 . After irradiation , the levels of ROS were increased in the 2Gy group than in the other groups . After treatment with NAC , the levels of ROS in each group increased . After treatment with NAC , the cells were treated with 8Gy X - ray , and the inhibitory rate of X - ray on U87MG cells was significantly decreased . Conclusion

1 . U87MG glioma cells have the characteristics of radiation resistance and anti - apoptosis .

2 . X - ray can inhibit the growth of U87MG glioma cells and has a correlation with dose intensity , and its inhibitory effect is realized by cell aging .

3.U87MG glioma cells can escape aging after receiving radiation , which may be one of the mechanisms of radiation resistance .

4 . ROS is one of the important molecules of X - ray radiation killing U87MG glioma , and the level of ROS produced during irradiation can increase the radiation resistance of U87MG glioma cells .

5 . Bmi - 1 may participate in the process of escaping aging after U87MG glioma radiation and has important status in it .

6 . The expression of Micro128a after U87MG glioma irradiation is related to dose intensity and is likely to be involved in the regulation of Bmi - 1 expression .
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 李方成,余進,陶宗玉,李軍亮,林吉惠;膠質(zhì)瘤細胞的生長速度與葡萄糖攝取的關系[J];中華實驗外科雜志;2003年10期

2 黃強;膠質(zhì)瘤起源細胞探討[J];中國微侵襲神經(jīng)外科雜志;2003年08期

3 王飛,李世亭;膠質(zhì)瘤的起源細胞與神經(jīng)干細胞的關系[J];中國腫瘤;2004年04期

4 高進喜,王守森,王如密;膠質(zhì)瘤化療進展[J];中國微侵襲神經(jīng)外科雜志;2004年05期

5 李蘊潛,李毅平,李才;基質(zhì)金屬蛋白酶2及其抑制物在人膠質(zhì)瘤中的表達[J];吉林大學學報(醫(yī)學版);2004年06期

6 岳武;宋大勇;孔令秀;趙釗;孟祥喜;張旭;王殿洪;王策;;體外超聲激活血卟啉單甲醚抗C6膠質(zhì)瘤細胞的研究[J];中國激光醫(yī)學雜志;2006年05期

7 高樹梓;高宜錄;林社裕;劉道坤;;C6膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清誘導神經(jīng)干細胞遷移的初步研究[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2006年04期

8 江濤;王忠誠;;構(gòu)建膠質(zhì)瘤綜合治療體系[J];河北醫(yī)藥;2007年01期

9 刁宏宇;張明杰;高連波;喻博;李少一;王成林;;基質(zhì)金屬蛋白酶9在膠質(zhì)瘤中的表達[J];中國醫(yī)科大學學報;2007年01期

10 李振飛;張梅奎;張笑明;尹嶺;;平瘤康方劑對C6膠質(zhì)瘤細胞增殖的抑制作用[J];中國康復理論與實踐;2007年05期

相關會議論文 前10條

1 楊孔賓;趙世光;劉炳學;陳曉豐;戴欽舜;;K~+通道阻斷劑四乙胺對大鼠膠質(zhì)瘤細胞的增殖和凋亡影響[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

2 黃強;;膠質(zhì)瘤生成細胞研究[A];第三屆中國腫瘤學術(shù)大會教育論文集[C];2004年

3 潘冬生;;聯(lián)合基因誘導體內(nèi)抗膠質(zhì)瘤免疫反應的實驗研究[A];2011中華醫(yī)學會神經(jīng)外科學學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

4 朱永堅;張建民;劉偉國;沈宏;;甲氧胺聯(lián)合β-欖香烯抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的實驗研究[A];中華醫(yī)學會神經(jīng)外科學分會第九次學術(shù)會議論文匯編[C];2010年

5 謝爽;王學美;謝東澤;;鮮壁虎提取物抑制C6膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的研究[A];第九屆全國中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學術(shù)研討會論文集[C];2002年

6 楊正欽;;姜黃素抑制C6膠質(zhì)瘤細胞增殖＼誘導其凋亡的分子機制[A];第十二屆全國神經(jīng)精神藥理學學術(shù)交流會論文集[C];2006年

7 張豫濱;楊孔賓;劉贊;葉遠柱;趙世光;;組蛋白去乙酰化酶抑制劑增加蛋白酶抑制劑對膠質(zhì)瘤的凋亡[A];第四屆中國腫瘤學術(shù)大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學術(shù)會議論文集[C];2006年

8 石鍵;傅偉明;張宏;陳鵬;;外源性wt p53基因及對大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞的熱增敏效應[A];2008年浙江省神經(jīng)外科學學術(shù)年會論文匯編[C];2008年

9 周朋;劉曉謙;胡煒;;耐藥基因的表達與體外藥敏試驗對膠質(zhì)瘤化療的指導意義[A];2011中華醫(yī)學會神經(jīng)外科學學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

10 趙世光;韓大勇;趙洪波;滕雷;李一;;三氧化二砷緩釋片體內(nèi)對C6膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

相關重要報紙文章 前5條

1 衣曉峰　馮宇曦;中藥三氧化二砷有望成為治療膠質(zhì)瘤新藥[N];中國醫(yī)藥報;2011年

2 記者 匡遠深;讓膠質(zhì)瘤干細胞不再“繁殖”[N];健康報;2011年

3 張獻懷　張文;瘤區(qū)埋雷 持續(xù)殺傷[N];健康報;2007年

4 白毅;人腦膠質(zhì)瘤基礎與應用研究喜結(jié)“九大碩果”[N];中國醫(yī)藥報;2006年

5 王德江；劉藏；王貴懷；曹勇；王新生；肖新如;交流最新進展 提高診治水平[N];中國醫(yī)藥報;2005年

相關博士學位論文 前10條

1 陳儇;氯化甲基汞抗鼠膠質(zhì)瘤細胞作用的體內(nèi)外實驗研究[D];吉林大學;2007年

2 俞磊;膠質(zhì)瘤中異檸檬酸脫氫酶基因的檢測及其對化療療效的影響[D];南方醫(yī)科大學;2012年

3 范左栩;低氧微環(huán)境對體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細胞增殖的影響及機制研究[D];浙江大學;2013年

4 黃吉煒;膠質(zhì)瘤特異性4optHBS-Msi1/GFAP啟動子的構(gòu)建評價及其在基因治療中的初步應用[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2009年

5 黃偉;EZH2基因調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學行為的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2010年

6 楊柳松;不同1p雜合性缺失特征少枝膠質(zhì)瘤的差異蛋白質(zhì)組學研究[D];復旦大學;2010年

7 楊冰;膠質(zhì)瘤相關新基因的研究[D];復旦大學;2005年

8 王舒楠;內(nèi)皮祖細胞參與膠質(zhì)瘤微血管形成及功能的活體影像學研究[D];第三軍醫(yī)大學;2012年

9 劉國棟;轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的載阿霉素氧化石墨烯納米粒抗膠質(zhì)瘤實驗研究[D];蘇州大學;2013年

10 范文海;蛋白酶體抑制劑對膠質(zhì)瘤細胞誘導凋亡作用及機制研究[D];吉林大學;2012年

相關碩士學位論文 前10條

1 孫珊珊;~1H-MRS在檢測膠質(zhì)瘤早期放療反應中的應用研究[D];山東大學;2012年

2 張軍霞;基因工程內(nèi)皮祖細胞介導的靶向血管新生治療膠質(zhì)瘤的研究[D];南京醫(yī)科大學;2008年

3 李宗豪;膠質(zhì)瘤干細胞研究進展[D];河北醫(yī)科大學;2009年

4 李科;苯丁酸鈉體外誘導大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞分化及凋亡的研究[D];山東大學;2010年

5 徐鑫;缺氧誘導因子-1α與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-3在膠質(zhì)瘤中的表達[D];河北醫(yī)科大學;2008年

6 蔣國梁;C6膠質(zhì)瘤細胞對神經(jīng)干細胞遷移的實驗研究[D];昆明醫(yī)學院;2009年

7 陳寶敏;膠質(zhì)瘤干細胞生物學特性比較及放射耐受機制的初步研究[D];蘇州大學;2010年

8 唐駿啟;牛黃體細胞與C6膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)及凋亡相關基因在大鼠黃體中的表達[D];西北農(nóng)林科技大學;2009年

9 沈云天;膠質(zhì)瘤干祖細胞在惡性膠質(zhì)瘤放射抗拒中作用的初步研究[D];蘇州大學;2008年

10 張景澤;逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT對大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞作用的體外研究[D];昆明醫(yī)學院;2009年

，

本文編號：2024118