發(fā)布時(shí)間：2018-06-09 23:43

  本文選題：急性腦梗死 + 血漿mi　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：卒中仍是當(dāng)代社會(huì)致死致殘的重要原因之一,許多卒中的幸存者都留下了終生的嚴(yán)重殘疾。而缺血性卒中占了整個(gè)卒中的80-85%。目前對(duì)急性腦梗死的診斷和預(yù)后判斷主要依靠病史、查體和影像學(xué)資料。但是影像學(xué)檢查的費(fèi)用較昂貴,耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),且部分患者的影像表現(xiàn)不典型。考慮到目前溶栓治療需限定4.5小時(shí)的時(shí)間窗,生物標(biāo)志物的運(yùn)用有可能加快診斷并影響治療方案的選擇。準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)卒中的預(yù)后對(duì)臨床實(shí)踐中的實(shí)施個(gè)性化治療是重要的。想要監(jiān)測(cè)患者在缺血性卒中急性期和恢復(fù)期的腦改變,血液標(biāo)本是最易獲得的材料。mi RNAs是一種近年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼小RNA,它通過(guò)與其目標(biāo)m RNA的3’-端非翻譯區(qū)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)。在過(guò)去的十年間,有許多證據(jù)證明了它們?cè)诟鞣N人類疾病(包括癌癥和心血管疾病)中的作用。而且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)血液中的核酸酶并不能破壞循環(huán)血mi RNAs。有學(xué)者深入研究發(fā)現(xiàn)血液中的mi RNAs含量的多次檢測(cè)結(jié)果是穩(wěn)定的,并且其含量高低與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。但是,缺血性卒中的mi RNAs的研究仍處于其早期階段。mi RNAs是一組具有獨(dú)特基因功能的內(nèi)源性核糖核酸調(diào)節(jié)子。它對(duì)解釋腦梗死的病理生理過(guò)程的潛在機(jī)制顯示了巨大的潛力。它在診斷和預(yù)測(cè)腦梗死的預(yù)后方面可能有重要的作用。因此,我們假設(shè)有特異的血漿mi RNAs表達(dá)譜可以提示急性腦梗死的病理生理過(guò)程和疾病狀態(tài),這些循環(huán)mi RNAs中的一部分有可能成為急性腦梗死無(wú)創(chuàng)性早期診斷的生物標(biāo)志物并預(yù)測(cè)其預(yù)后。本研究的主要目的有二:1、建立實(shí)驗(yàn)室血漿mi RNAs高效、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)平臺(tái);2、探討血漿mi RNAs作為急性腦梗死早期生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。本研究涉及的主要技術(shù)和方法:血液標(biāo)本的初步處理和儲(chǔ)存,血漿總RNA的抽提,q RT-PCR,血漿mi RNAs芯片,醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)。第一部分急性腦梗死循環(huán)血mi RNAs芯片表達(dá)譜的變化研究目的:研究健康志愿者的血漿mi RNAs含量和分布情況,建立急性腦梗死患者與健康志愿者血漿mi RNAs的差異表達(dá)譜。方法:分別采集4例健康志愿者和7例急性腦梗死患者的血漿,以mir Vana PARIS Kit(Applied Biosystem p/n AM1556)提取總RNA,采用Agilent mi RNA芯片技術(shù)(19.0version),進(jìn)行質(zhì)檢、熒光標(biāo)記、雜交和掃描。以平均信號(hào)值2為有效信號(hào),分析健康志愿者血漿mi RNAs表達(dá)譜及急性腦梗死患者與健康志愿者血漿mi RNAs的差異表達(dá)譜。結(jié)果:1、利用mi RNAs芯片技術(shù)可以檢測(cè)出血漿中142條mi RNAs,其中平均信號(hào)強(qiáng)度值小于100的mi RNAs有106條,占總mi RNAs數(shù)的74.6%,大部分血漿mi RNAs含量非常微弱。2、除了mi R-21-5p(2.87±5.41)以外其余與腦相關(guān)的mi RNAs在健康志愿者血漿中檢測(cè)不到。3、除mi R-122在芯片中具有有效信號(hào)值(72.75±145.15)以外,絕大多數(shù)組織特異的mi RNAs在健康人血漿中檢測(cè)不到信號(hào)。4、急性腦梗死患者和健康志愿者血漿mi RNAs表達(dá)存在較大差異,11個(gè)mi RNAs表達(dá)上調(diào),1個(gè)表達(dá)下調(diào)。除mi R-223-3p和mi R-16-5p以外,大部分組織特異的mi RNAs并沒(méi)有檢測(cè)出明顯的變化。結(jié)論:通過(guò)mi RNAs芯片可以檢測(cè)血漿中的mi RNAs,大部分血漿mi RNAs含量非常微弱;大部分與腦相關(guān)和組織特異mi RNAs在健康志愿者血漿中含量微弱;急性腦梗死患者和健康志愿者血漿mi RNAs表達(dá)存在較大差異,大部分腦相關(guān)和組織特異的mi RNAs并沒(méi)有檢測(cè)出明顯的變化。第二部分循環(huán)血mi RNAs定量檢測(cè)平臺(tái)的建立和優(yōu)化研究目的:建立血漿mi RNAs的科學(xué)的檢測(cè)平臺(tái),探討技術(shù)細(xì)節(jié)以形成標(biāo)準(zhǔn)化流程。方法:1、以兩步法分離血漿,以TRI REAGENT BD和S/P RNAiso kit進(jìn)行血漿總RNA的抽提,比較兩種方法的得率。2、以SYBR Green法【Rever Tra Ace Qpcr RT Kit和Real-time PCR Master Mix(TOYOBO)】和S-Poly(T)法進(jìn)行血漿mi RNAs的q RT-PCR檢測(cè),初步比較兩種方法的靈敏度和特異度。3、兩種體系的熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線的線性范圍的研究。結(jié)果:1、抽提血漿總RNA TRI REAGENT BD方法的得率比S/P RNAiso kit低。2、q RT-PCR的兩種方法相比,Poly(A)加尾法的靈敏度較好,SYBR Green的特異度較好。3、S-Poly(T)法q RT-PCR體系中對(duì)于外源性的參比基因cel-mi R-54,當(dāng)其CT值在27以上時(shí),其CT值與濃度的關(guān)系已不符合理想的線性關(guān)系;對(duì)于內(nèi)源性的待測(cè)基因mi R-16,CT值大于28時(shí)不再與濃度成線性關(guān)系。結(jié)論:以兩步法分離血漿,以S/P RNAiso kit抽提血漿總RNA;以cel-mi R-54作為外源性的參比基因;以S-Poly(T)法行q RT-PCR檢測(cè)mi RNAs;內(nèi)源性的待測(cè)mi RNAs當(dāng)CT值大于28時(shí)不再與濃度成良好的線性關(guān)系。第三部分循環(huán)血mi RNAs早期診斷急性腦梗死的價(jià)值及其與預(yù)后關(guān)系的研究目的:1、在小樣本的急性腦梗死患者和對(duì)照人群中,評(píng)價(jià)候選標(biāo)志物診斷急性腦梗死的價(jià)值,隨后將慢性腦梗死也納入評(píng)價(jià)體系之中;2、在小樣本的急性腦梗死患者中,評(píng)價(jià)候選標(biāo)志物判斷患者預(yù)后的價(jià)值。方法:1、采集急性腦梗死患者27例、慢性腦梗死患者28例、健康志愿者26例的血漿,利用q RT-PCR進(jìn)行mi RNAs定量分析;2、挑選芯片的差異表達(dá)譜中熒光信號(hào)較高的mi RNAs并結(jié)合文獻(xiàn)確定候選標(biāo)志物,分析其在急性患者和健康者之間的差異,并分析其在急性、慢性腦梗死患者、健康志愿者之間的差異;3、將急性腦梗死患者分為預(yù)后不佳組(MRS 3-6)和預(yù)后良好組(MRS 0-2),挑選在急性患者和健康志愿者之間有差異的mi RNAs,進(jìn)一步分析其在預(yù)后不佳組和預(yù)后良好組之間的差異。結(jié)果:1、急性患者與志愿者二組評(píng)價(jià)時(shí),急性腦梗死患者血漿中mi R-16和let-7i平均水平較健康志愿者明顯升高,具有顯著性差異(p0.05),而mi R-106b,mi R-130a,mi R-223,mi R-25,mi R-140,mi R-4454在兩組之間無(wú)顯著性差異。三組人群統(tǒng)一評(píng)價(jià)時(shí),mi R-16和let-7i都能區(qū)分急性患者和志愿者,但let-7i能區(qū)分急性和慢性腦梗死患者,而mi R-16不能。let-7i對(duì)急性腦梗死特異性更強(qiáng)。2、預(yù)后不良組的mi R-16和let-7i平均表達(dá)水平均較預(yù)后良好組顯著升高,兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:來(lái)自于芯片差異表達(dá)譜的mi R-16和來(lái)源于文獻(xiàn)復(fù)習(xí)的let-7i在急性腦梗死患者和健康志愿者的血漿中有顯著性差異,其中l(wèi)et-7i可以區(qū)分急性和慢性腦梗死。其對(duì)急性腦梗死診斷價(jià)值更高,可用于排除腦梗死復(fù)發(fā)。mi R-16和let-7i在預(yù)后不佳和預(yù)后良好的急性腦梗死患者的血漿之間有顯著性差異。小結(jié):本研究關(guān)注急性腦梗死的早期診斷,結(jié)合mi RNAs芯片及熒光定量PCR的最新技術(shù)進(jìn)展,全面分析了健康志愿者的血漿mi RNAs表達(dá)譜,急性腦梗死患者和健康志愿者的血漿mi RNAs差異表達(dá)譜,建立了循環(huán)血mi RNAs科學(xué)的檢測(cè)平臺(tái),結(jié)合小樣本的臨床患者,研究了芯片差異表達(dá)的mi RNAs在急性腦梗死后血漿中的變化情況,評(píng)價(jià)了血漿mi RNAs在急性腦梗死中的早期診斷及預(yù)后判斷的價(jià)值,不僅闡明了血漿mi RNAs可作為急性腦梗死早期診斷潛在的生物標(biāo)志物的概念,篩選并鑒定了以let-7i為代表的兩個(gè)具有潛在臨床價(jià)值的mi RNAs,同時(shí)提出了從血漿芯片的差異表達(dá)譜出發(fā)來(lái)尋找急性腦梗死血漿生物標(biāo)志物的研究思路。
[Abstract]:In the past decade , it is important to study the role of plasma mi RNAs in the diagnosis and prognosis of acute cerebral infarction . In addition to mi R - 21 - 5p ( 2.87 鹵 5.41 ) , mi RNAs in most tissues were not detected . The sensitivity and specificity of the two methods were compared with that of S / P RNAiso kit . The mi R - 16 and let - 7i in patients with acute cerebral infarction were significantly higher than those in healthy volunteers . In this paper , we have established the detection platform of circulating blood mi RNAs , combined with the clinical patients of small samples , studied the changes of mi - RNAs in plasma after acute cerebral infarction , and evaluated the value of plasma mi - RNAs in the early diagnosis and prognosis of acute cerebral infarction .
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743.3

【共引文獻(xiàn)】

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1 鄧鈴;羅霞;楊e，

本文編號(hào)：2001233