本文選題：肢體缺血預(yù)處理 + 腦缺血耐受��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：腦缺血性疾病是危害人類健康的常見病、多發(fā)病。不可忽視的問題是，神經(jīng)元對缺血性損害極為敏感，經(jīng)過一定時間的缺血后，神經(jīng)元會大量死亡，即使恢復(fù)血液供應(yīng)，亦難以再生，給患者留下嚴重的后遺癥。因此，提高神經(jīng)元對缺血性損害的抵抗力，使其在蒙受嚴重的缺血時減輕損傷、保持存活，以保證恢復(fù)血液供應(yīng)后仍具有正常的生理功能，是此類疾病治療上的一個重要策略。 繼日本學(xué)者Kitagawa等首次發(fā)現(xiàn)短暫性腦缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)腦缺血耐受的現(xiàn)象后，大量的研究人員進行了此方面的研究，并證實了這種同一器官的缺血預(yù)處理的保護作用。盡管腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受是一種強大的內(nèi)源性保護作用，然而對中樞器官進行缺血預(yù)處理，很難作為一種預(yù)防措施直接應(yīng)用于臨床。隨著對缺血預(yù)處理途徑和方法的進一步研究，又相繼發(fā)現(xiàn)了肢體、腎臟及小腸等遠隔器官的短暫性缺血可對后續(xù)的缺血再灌注損傷的心肌發(fā)揮保護作用，這種通過不同器官缺血預(yù)處理發(fā)揮保護作用的現(xiàn)象稱為遠端器官缺血預(yù)處理（remote ischemic preconditi-oning, RIPC）。 我室既往研究證實，反復(fù)3次股動脈夾閉和再灌注的肢體缺血預(yù)處理（limb ischemic preconditioning, LIP）可減輕隨后即刻發(fā)生的腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元延遲性死亡和凋亡、誘導(dǎo)腦缺血耐受，證實了遠隔器官缺血預(yù)處理對腦的保護作用。在進一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，LIP可通過上調(diào)大鼠海馬p38MAPK的表達發(fā)揮腦保護作用。但是，缺血預(yù)處理的肢體與遭受缺血打擊的大腦之間相隔較遠，由LIP啟動的保護性信號如何作用于腦，又通過哪些途徑上調(diào)海馬p38MAPK的表達尚不完全清楚。趙紅崗等研究證實，LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)可部分阻斷LIP對腦缺血的保護作用，提示神經(jīng)途徑參與了LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受。有國外學(xué)者研究證實，遠程雙下肢亞致死性缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)24h內(nèi)的腦缺血耐受，這種保護作用在一定程度上可能是通過神經(jīng)源性途徑介導(dǎo)的。 基于以上結(jié)論，本課題的研究目的在于：①觀察切斷雙側(cè)股神經(jīng)和或坐骨神經(jīng)對肢體缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受的影響；②觀察切斷雙側(cè)股神經(jīng)和或坐骨神經(jīng)在肢體缺血預(yù)處理腦保護中是否影響大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK的表達。通過上述研究，探討股神經(jīng)和或坐骨神經(jīng)是否在肢體缺血預(yù)處理腦保護及上調(diào)p38MAPK的表達中發(fā)揮作用。這些問題的解決，可為研究開發(fā)提高神經(jīng)元對缺血性損害耐受性的方法和腦缺血性疾病的預(yù)防與治療提供新思路。 1股神經(jīng)和或坐骨神經(jīng)在肢體缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受中的作用 99只Wistar大鼠永久凝閉雙側(cè)椎動脈后恢復(fù)兩天，隨機分為以下9組：①全腦缺血的sham組（n=11）：只暴露雙側(cè)頸總動脈，不阻斷血流；②全腦缺血組（brain ischemia, BI）（n=11）：夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復(fù)再灌注；③LIP+全腦缺血組（LIP+BI）（n=11）：夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌注10min、反復(fù)3次作為肢體缺血預(yù)處理后，即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8min作為損傷性缺血，然后恢復(fù)再灌注；④股神經(jīng)切斷（femoralnerve resection, FNS）+全腦缺血組（n=11）：切斷雙側(cè)股神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血；⑤股神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血（FNS+LIP+BI）組（n=11）：LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血；⑥坐骨神經(jīng)切斷（sciatic nerve resection, SNS）+全腦缺血組（n=11）：切斷雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血；⑦坐骨神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血（SNS+LIP+BI）組（n=11）：LIP前切斷雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血；⑧股神經(jīng)切斷+坐骨神經(jīng)切斷+全腦缺血（FNS+SNS+BI）組（n=11）：切斷雙側(cè)股神經(jīng)及雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血；⑨股神經(jīng)切斷+坐骨神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血（FNS+SNS+LIP+BI）組（n=11）：LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)及雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血。以上各組大鼠分別取6只在sham或末次缺血再灌注后7d斷頭取腦，冠狀切片后進行硫冸染色。低倍鏡下觀察硫堇染色的海馬組織形態(tài)，參照Kitagawa（1990）和Kato（1991）分級方法，對海馬CA1區(qū)確定組織學(xué)分級（histological grade, HG），標準如下：0級：無神經(jīng)元死亡； I級：散在神經(jīng)元死亡；II級：成片神經(jīng)元死亡；III級：幾乎全部神經(jīng)元死亡。高倍顯微鏡下計數(shù)雙側(cè)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目，每張切片雙側(cè)海馬各計數(shù)3個區(qū)段，，取平均數(shù)作為神經(jīng)元密度（neuronal density, ND）。各組大鼠其余5只在sham或末次缺血再灌注后3d斷頭取腦，冠狀切片后進行TUNEL染色計數(shù)凋亡細胞。高倍顯微鏡下計數(shù)雙側(cè)海馬CA1區(qū)1mm區(qū)段內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)，每側(cè)海馬CA1區(qū)各計數(shù)3個區(qū)段，取其平均數(shù)。 硫冸染色結(jié)果顯示，全腦缺血的sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊、致密，為2～3層，細胞形態(tài)完整、邊界清晰，無細胞缺失，胞核飽滿、核仁深染、清晰，無明顯的延遲性神經(jīng)元死亡（delayed neuronaldeath, DND），HG為0級，ND值為223±20.23（cells mm，下同）。全腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)有明顯的組織學(xué)損傷，出現(xiàn)嚴重的DND，錐體細胞形態(tài)改變明顯，幾乎全部神經(jīng)元死亡或缺失，HG為III級，ND值為46±12.52，與sham組相比，HG明顯升高（P＜0.01），ND值明顯降低（P＜0.01）。LIP+BI組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元未見明顯損傷，僅個別細胞胞核固縮，細胞排列整齊，無明顯細胞缺失，與BI組相比，HG（0～I）明顯降低、ND值（198±19.49）明顯升高（P＜0.01）。FNS+LIP+BI組、SNS+LIP+BI組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元有明顯組織學(xué)損傷，細胞形態(tài)發(fā)生改變，成片死亡或缺失，與LIP+BI組相比，HG（I～II級）升高（P＜0.01），ND值（165.83±21.33,173±13.59）明顯降低（P＜0.01）。FNS+SNS+LIP+BI組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元成片死亡，出現(xiàn)嚴重的DND，錐體細胞形態(tài)改變明顯，組織學(xué)損傷嚴重，HG為II～III級，ND值為93±8.17，與LIP+BI組相比，HG明顯升高（P＜0.01），ND值明顯降低（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，肢體缺血預(yù)處理明顯減輕了大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡、發(fā)揮了腦保護作用，而分別或聯(lián)合切斷雙側(cè)股神經(jīng)和坐骨神經(jīng)均可以部分阻斷LIP的上述腦保護作用，提示神經(jīng)途徑參與了LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受。 TUNEL染色結(jié)果顯示，腦缺血的sham組海馬CA1區(qū)偶有棕黃色深染的TUNEL陽性細胞，神經(jīng)元體積變小，核固縮，呈圓點狀或扇形，染色質(zhì)呈新月形或條形聚集于核周。腦缺血組海馬CA1區(qū)可見大量的TUNEL陽性細胞，與sham組相比細胞數(shù)目明顯增加（P＜0.01），提示8min的全腦缺血對大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的打擊是致命的，引起大量的神經(jīng)元細胞凋亡。LIP+BI組TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)與腦缺血組相比明顯減少（P＜0.01），說明LIP明顯抑制全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體細胞凋亡，誘導(dǎo)了腦缺血耐受。與LIP+BI組相比，F(xiàn)NS+LIP+BI組、SNS+LIP+BI組和FNS+SNS+LIP+BI組，海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)明顯增加，表明分別或聯(lián)合切斷雙側(cè)股神經(jīng)和坐骨神經(jīng)可拮抗LIP抑制凋亡的作用。 2股神經(jīng)和或坐骨神經(jīng)在肢體缺血預(yù)處理上調(diào)海馬CA1區(qū)p38MAPK表達中的作用 90只Wistar大鼠永久凝閉雙側(cè)椎動脈恢復(fù)兩天后，隨機分為以下9組：①全腦缺血的sham組（n=10）：只暴露雙側(cè)頸總動脈，不阻斷血流；②全腦缺血組（brain ischemia, BI）（n=10）：夾閉雙側(cè)頸總動脈8min后恢復(fù)再灌注；③LIP+BI組（n=10）：夾閉雙側(cè)股動脈10min、再灌注10min、反復(fù)3次作為肢體缺血預(yù)處理后，即刻夾閉雙側(cè)頸總動脈8min作為損傷性缺血，然后恢復(fù)再灌注；④股神經(jīng)切斷（femoral nerve resection, FNS）+全腦缺血組（n=10）：切斷雙側(cè)股神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血；⑤股神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血（FNS+LIP+BI）組（n=10）：LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血。⑥坐骨神經(jīng)切斷（sciatic nerve resection,SNS）+全腦缺血組（n=10）：切斷雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血；⑦坐骨神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血（SNS+LIP+BI）組（n=10）：LIP前切斷雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血；⑧股神經(jīng)切斷+坐骨神經(jīng)切斷+全腦缺血（FNS+SNS+BI）組（n=10）：切斷雙側(cè)股神經(jīng)及雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血；⑨股神經(jīng)切斷+坐骨神經(jīng)切斷+LIP+全腦缺血（FNS+SNS+LIP+BI）組（n=10）：LIP前切斷雙側(cè)股神經(jīng)及雙側(cè)坐骨神經(jīng)，即刻給予8min全腦缺血。以上各組大鼠在sham手術(shù)或末次缺血再灌注12h斷頭取腦，各組分別取5只用于免疫組織化學(xué)、5只用于Western blotting，檢測大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK的表達。 免疫組化結(jié)果顯示，全腦缺血的sham組和全腦缺血組海馬CA1區(qū)p-p38MAPK陽性表達較少，陽性細胞胞核著色，呈棕黃色，染色淺，積分光密度分別為3.37±0.12、3.30±0.03，陽性細胞總面積分別為6056.23±522.3、6106.62±458.43（μm2,下同）。LIP+BI組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元p-p38MAPK的表達明顯增多，胞核著色加深，呈深棕黃色，其積分光密度和陽性細胞總面積分別為11.90±0.27和12036.60±693.91，與BI組相比有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01），表明LIP能夠上調(diào)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK的表達。與LIP+BI組相比，F(xiàn)NS+LIP+BI組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中p-p38MAPK的表達量較少，胞核染色較淺，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01），其積分光密度和陽性細胞總面積分別為4.63±0.07和6561.17±301.5。SNS+LIP+BI組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中p-p38MAPK的表達量降低，與LIP+BI組相比，陽性細胞積分光密度（5.07±0.13）和陽性細胞總面積（6835.91±401.47）均有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。FNS+SNS+LIP+BI組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中p-p38MAPK的表達量少，胞核著色淺，陽性細胞積分光密度和總面積分別為3.15±0.22和6361.81±210.41，與LIP+BI組相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。上述實驗結(jié)果表明分別或聯(lián)合切斷雙側(cè)股神經(jīng)和坐骨神經(jīng)能阻斷LIP對腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK表達的上調(diào)作用。 Western blot結(jié)果顯示，全腦缺血的sham組和全腦缺血組海馬CA1區(qū)p-p38MAPK的表達量很低。LIP+BI組的p-p38MAPK的表達量明顯增加，與BI組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。FNS+LIP+BI組、SNS+LIP+BI組和FNS+SNS+LIP+BI組中p-p38MAPK的表達量較少，與LIP+BI組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.01）。以上結(jié)果表明，LIP能夠上調(diào)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK的表達，而LIP的此種作用可被股神經(jīng)和或坐骨神經(jīng)切斷所阻斷。 結(jié)論： （1）切斷雙側(cè)股神經(jīng)和或坐骨神經(jīng)可部分阻斷LIP的腦保護作用，提示LIP對腦缺血的保護作用中有神經(jīng)機制的參與。 （2）切斷雙側(cè)股神經(jīng)和或坐骨神經(jīng)可以阻斷LIP抑制腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的作用。 （3）切斷雙側(cè)股神經(jīng)和或坐骨神經(jīng)可以阻斷LIP對腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)p38MAPK表達的上調(diào)作用，提示LIP可通過神經(jīng)機制上調(diào)p38MAPK的表達。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

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本文編號：1974564