本文選題：肌萎縮側(cè)索硬化 + 超氧化物歧化酶�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：肌萎縮側(cè)索硬化是一種神經(jīng)變性疾病，其特征是選擇性的侵犯脊髓前角細(xì)胞、腦干后組運動神經(jīng)元、皮質(zhì)錐體細(xì)胞及錐體束，導(dǎo)致上、下運動神經(jīng)元變性死亡，患者出現(xiàn)嚴(yán)重的肌無力，多數(shù)終因呼吸肌受累而死于呼吸衰竭。全世界范圍內(nèi)對ALS的研究目前主要集中于SOD1-G93A的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，所以將研究擴(kuò)展到其他模型以進(jìn)一步探討SOD1-G93A在ALS致病中的作用就具有重要意義。本實驗采用突變的人SOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，從氧化應(yīng)激、線粒體異常改變以及細(xì)胞凋亡的角度探討SOD1-G93A對PC12細(xì)胞的影響極其可能的作用機(jī)制。為將來進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。 方法： 1實驗分組 實驗設(shè)置空白對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對照組以及轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A組。 2細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇凍存于液氮罐中的高分化PC12細(xì)胞，以含有滅活的胎牛血清及青鏈霉素的10%高糖DMEM作為培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇傳代3次以后，待突起明顯、形態(tài)規(guī)則、融合密度為80%時，取對數(shù)生長期分別轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A質(zhì)粒、空質(zhì)粒至PC12細(xì)胞。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格遵守LipofectamineTM2000試劑說明書的操作規(guī)范。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞樣本用于實驗研究。 3丙二醛檢測 收集并裂解細(xì)胞，使用硫代巴比妥酸（TBARS）法測定細(xì)胞MDA水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實驗操作，在532nm波長處讀取樣本吸光度。 4蛋白質(zhì)免疫印跡 提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度。以30ug蛋白為上樣量，進(jìn)行鈉十二烷基的硫酸鹽(SDS)聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜與一抗在4℃搖床下孵育過夜。次日再與結(jié)合有熒光染料的二抗孵育。Odyssey紅外圖像掃描系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行掃描以確定目的蛋白的表達(dá)水平。 5細(xì)胞凋亡率測定 消化貼壁的PC12細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，離心去上清以后加入PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)，取1-5x105個細(xì)胞離心去上清，加入500ul1x Bindingbuffer重懸細(xì)胞，加入10ul PI，室溫避光孵育5min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。 6活細(xì)胞線粒體觀測 用移液器沿側(cè)壁小心去除激光共聚焦顯微鏡專用玻底培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃溫浴的D-Hank’s洗兩遍，加入1ml不含酚紅和抗生素的DMEM培養(yǎng)基，按線粒體染色劑（mitored tracker）/培養(yǎng)基為1:1000的比例，加入線粒體染色劑，輕輕混勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育45分鐘。15分鐘后以1:500的比例加入核染色劑Hoechst，培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。孵育完畢后去除培養(yǎng)液，D-Hank’s洗一遍，加入不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基，拿出培養(yǎng)室進(jìn)行confocal觀測。 結(jié)果： 1成功的培養(yǎng)PC12細(xì)胞并完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 倒置熒光顯微鏡顯微鏡下觀察，我們培養(yǎng)的PC12細(xì)胞貼壁良好形態(tài)規(guī)則，突起明顯；SOD1-G93A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，蛋白質(zhì)免疫印跡法在對應(yīng)位置檢測到含有EGFP標(biāo)簽的外源性SOD1，流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染效率為20.1%。 2丙二醛水平測定 MDA含量代表了細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，可間接反映氧化應(yīng)激水平。轉(zhuǎn)染48h后提取細(xì)胞蛋白測定MDA，結(jié)果顯示SOD1-G93A組MDA值明顯高于對照組（p0.01），，有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A引發(fā)了PC12細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷。 3血紅素氧合酶1表達(dá)水平測定 HO-1是體內(nèi)重要的抗氧化酶，在多種刺激條件下可被誘導(dǎo)，比如氧化應(yīng)激。在PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A，48h后提取細(xì)胞蛋白用于蛋白質(zhì)免疫印跡，觀測血紅素氧合酶1的變化。結(jié)果顯示HO-1在轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A組相比于對照組明顯升高（p0.01)，有統(tǒng)計學(xué)意義。 4細(xì)胞凋亡率 凋亡中、晚期細(xì)胞，細(xì)胞膜的完整性受到比較嚴(yán)重的破壞，溴化乙錠可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)將細(xì)胞核紅染，以此可較為客觀地判定細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A48h后收集細(xì)胞用于凋亡率檢測。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染人SOD1-G93A組細(xì)胞凋亡率高達(dá)40.9%，正常對照組僅為9.7%。 5線粒體形態(tài)改變 轉(zhuǎn)染48h后hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，mitored標(biāo)記線粒體，直接觀測激光共聚焦顯微鏡專用玻底培養(yǎng)皿中的活細(xì)胞。過表達(dá)SOD1-G93A組細(xì)胞出現(xiàn)較為明顯的線粒體碎片，且偶見巨型線粒體聚集體。 結(jié)論： SOD1-G93A在PC12細(xì)胞可引起細(xì)胞功能障礙。主要表現(xiàn)為： 1導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，繼而引起脂質(zhì)過氧化損害。 2上調(diào)了HO-1的表達(dá)水平 3引起線粒體異常改變 4細(xì)胞凋亡率異常升高
[Abstract]:Amyotrophic lateral sclerosis (amyotrophic lateral sclerosis) is a neurodegenerative disease characterized by selective invasion of the spinal cord anterior horn cells, motor neurons in the brain stem, cortical pyramidal cells and pyramidal bundles, leading to degeneration and death of upper and lower motor neurons, severe myasthenia in patients, and death of respiratory failure due to respiratory muscle involvement. All over the world The study of ALS is mainly focused on the transgenic mouse model of SOD1-G93A, so it is of great significance to extend the study to other models to further explore the role of SOD1-G93A in the pathogenesis of ALS. This experiment uses a mutant human SOD1-G93A plasmid to transfect PC12 cells, from oxygen stress, abnormal mitochondrial change and cell apoptosis. From the point of view, the possible mechanism of the effect of SOD1-G93A on PC12 cells is discussed, which will lay a foundation for further research in the future.
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本文編號：1950044