本文選題：BAG-1L基因 + 神經(jīng)細(xì)胞��； 參考：《青島大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的探討重組慢病毒介導(dǎo)的BCL-2結(jié)合抗凋亡基因(BCL-2 associated athanogene-1,BAG-1)過(guò)表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)損傷的保護(hù)作用,并研究其與熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的相互作用以及對(duì)磷酸肌醇-3/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影響。方法構(gòu)建表達(dá)外源性BAG-1L基因的重組慢病毒,感染體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞,感染48 h后采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)檢測(cè)靶細(xì)胞中BAG-1L蛋白的表達(dá)。經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)BAG-1L基因的SH-SY5Y細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,即重組慢病毒感染組(感染攜帶BAG-1L基因和熒光蛋白基因的慢病毒),同時(shí)設(shè)置載體對(duì)照組(感染攜帶熒光蛋白基因但不攜帶BAG-1L基因的慢病毒)和細(xì)胞對(duì)照組(未感染慢病毒)。對(duì)3組細(xì)胞分別進(jìn)行缺氧4 h,8 h,16 h,24 h再?gòu)?fù)氧24 h處理,采用細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞活性,選擇最佳缺氧時(shí)間用于研究。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析缺氧8 h處理后3組細(xì)胞凋亡情況;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)檢測(cè)缺氧8 h處理后BAG-1L,HSP70以及AKT m RNA轉(zhuǎn)錄水平;Western Blot技術(shù)檢測(cè)缺氧8 h后BAG-1L,HSP70,AKT,磷酸化AKT(Phosphorylated AKT,p-AKT)蛋白水平。組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果1.BAG-1L過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功,感染SH-SY5Y細(xì)胞48 h后重組慢病毒感染組檢測(cè)到外源性BAG-1L蛋白條帶。2.隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),3組細(xì)胞活性均呈先上升后下降的趨勢(shì),8 h達(dá)高峰,故選缺氧8 h復(fù)氧24 h作為神經(jīng)細(xì)胞缺氧的模型。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,缺氧8 h處理后重組慢病毒感染組比細(xì)胞對(duì)照組和載體對(duì)照組細(xì)胞活性均明顯增高(A值:0.689±0.036比0.425±0.013、0.400±0.012,均P㩳0.01)。3.重組慢病毒感染組、細(xì)胞對(duì)照組和載體對(duì)照組缺氧8 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,細(xì)胞凋亡率(%)分別為:26.97±1.82、36.4±1.45和35.77±3.74;重組慢病毒感染組缺氧8 h后細(xì)胞凋亡情況明顯低于其他2組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P㩳0.01)。4.RT-q PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,重組慢病毒感染組、載體對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組缺氧8 h后m RNA轉(zhuǎn)錄水平分別為BAG-1L m RNA(2-ΔΔCt):559.806±74.079、1.010±0.092和1.003±0.101,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,重組慢病毒感染組細(xì)胞活性明顯高于其他2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P㩳0.01);HSP70 m RNA(2-ΔΔCt):3.987±0.412、1.084±0.090和1.005±0.116,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,重組慢病毒感染組細(xì)胞活性明顯高于其他2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P㩳0.01);AKT m RNA(2-ΔΔCt):0.959±0.286、1.133±0.311和1.142±0.655,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P㧐0.05)。5.Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,重組慢病毒感染組、載體對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組缺氧8 h后BAG-1L蛋白表達(dá)水平分別為(灰度值):2.405±0.167比0.529±0.141、0.601±0.099,均P㩳0.01;HSP70蛋白表達(dá)水平分別為(灰度值):0.997±0.123比0.634±0.091、0.584±0.106,均P㩳0.01,p-AKT蛋白表達(dá)水平分別為(灰度值):1.234±0.118比0.661±0.210、0.712±0.199,均P㩳0.05。重組慢病毒感染組均高于細(xì)胞對(duì)照組和載體對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P㩳0.05)。重組慢病毒感染組AKT蛋白表達(dá)高于其他兩組,但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(灰度值:1.103±0.269比0.646±0.188、0.791±0.326,均P㧐0.05)。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的BAG-1L基因過(guò)表達(dá)可以降低缺氧引起的SH-SY5Y細(xì)胞損傷,抑制細(xì)胞凋亡;對(duì)細(xì)胞內(nèi)HSP70、p-AKT蛋白表達(dá)具有顯著影響,即BAG-1L過(guò)表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)HSP70的表達(dá)及促進(jìn)PI3K/AKT通路的激活,進(jìn)而對(duì)缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用;可能從分子水平上為臨床上缺血性腦血管病的防治提供科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:Objective To investigate the protective effects of recombinant lentivirus - mediated bcl - 2 - associated athanogene - 1 ( BAG - 1 ) on hypoxia - induced apoptosis of human neuroblastomas ( SH - SYY ) cells . The expression of BAG - 1L protein was detected by Western Blot . The results showed that the expression levels of BAG - 1L after hypoxia for 8 h were significantly higher than those in other 2 groups ( P ? 0 . 01 ) ; the levels of apoptosis in the recombinant lentivirus group , the control group and the control group were significantly higher than those in other 2 groups ( P ? 0.01 ) .
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1930021