本文選題：BAG-1L基因 + 神經細胞　； 參考：《青島大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的探討重組慢病毒介導的BCL-2結合抗凋亡基因(BCL-2 associated athanogene-1,BAG-1)過表達對缺氧誘導的人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)損傷的保護作用,并研究其與熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的相互作用以及對磷酸肌醇-3/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影響。方法構建表達外源性BAG-1L基因的重組慢病毒,感染體外培養(yǎng)對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞,感染48 h后采用蛋白質免疫印跡實驗(Western Blot)檢測靶細胞中BAG-1L蛋白的表達。經嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達BAG-1L基因的SH-SY5Y細胞作為實驗組,即重組慢病毒感染組(感染攜帶BAG-1L基因和熒光蛋白基因的慢病毒),同時設置載體對照組(感染攜帶熒光蛋白基因但不攜帶BAG-1L基因的慢病毒)和細胞對照組(未感染慢病毒)。對3組細胞分別進行缺氧4 h,8 h,16 h,24 h再復氧24 h處理,采用細胞增殖與活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)檢測不同處理條件下細胞活性,選擇最佳缺氧時間用于研究。流式細胞儀檢測分析缺氧8 h處理后3組細胞凋亡情況;實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)檢測缺氧8 h處理后BAG-1L,HSP70以及AKT m RNA轉錄水平;Western Blot技術檢測缺氧8 h后BAG-1L,HSP70,AKT,磷酸化AKT(Phosphorylated AKT,p-AKT)蛋白水平。組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果1.BAG-1L過表達慢病毒載體構建成功,感染SH-SY5Y細胞48 h后重組慢病毒感染組檢測到外源性BAG-1L蛋白條帶。2.隨著缺氧時間延長,3組細胞活性均呈先上升后下降的趨勢,8 h達高峰,故選缺氧8 h復氧24 h作為神經細胞缺氧的模型。CCK-8檢測結果顯示,缺氧8 h處理后重組慢病毒感染組比細胞對照組和載體對照組細胞活性均明顯增高(A值:0.689±0.036比0.425±0.013、0.400±0.012,均P㩳0.01)。3.重組慢病毒感染組、細胞對照組和載體對照組缺氧8 h后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,細胞凋亡率(%)分別為:26.97±1.82、36.4±1.45和35.77±3.74;重組慢病毒感染組缺氧8 h后細胞凋亡情況明顯低于其他2組,差異具有統(tǒng)計學意義(均P㩳0.01)。4.RT-q PCR檢測結果顯示,重組慢病毒感染組、載體對照組和細胞對照組缺氧8 h后m RNA轉錄水平分別為BAG-1L m RNA(2-ΔΔCt):559.806±74.079、1.010±0.092和1.003±0.101,統(tǒng)計學分析表明,重組慢病毒感染組細胞活性明顯高于其他2組,差異有統(tǒng)計學意義(均P㩳0.01);HSP70 m RNA(2-ΔΔCt):3.987±0.412、1.084±0.090和1.005±0.116,統(tǒng)計學分析表明,重組慢病毒感染組細胞活性明顯高于其他2組,差異有統(tǒng)計學意義(均P㩳0.01);AKT m RNA(2-ΔΔCt):0.959±0.286、1.133±0.311和1.142±0.655,統(tǒng)計學分析表明,3組差異無統(tǒng)計學意義(均P㧐0.05)。5.Western Blot檢測結果顯示,重組慢病毒感染組、載體對照組和細胞對照組缺氧8 h后BAG-1L蛋白表達水平分別為(灰度值):2.405±0.167比0.529±0.141、0.601±0.099,均P㩳0.01;HSP70蛋白表達水平分別為(灰度值):0.997±0.123比0.634±0.091、0.584±0.106,均P㩳0.01,p-AKT蛋白表達水平分別為(灰度值):1.234±0.118比0.661±0.210、0.712±0.199,均P㩳0.05。重組慢病毒感染組均高于細胞對照組和載體對照組,差異有統(tǒng)計學意義(均P㩳0.05)。重組慢病毒感染組AKT蛋白表達高于其他兩組,但差異沒有統(tǒng)計學意義(灰度值:1.103±0.269比0.646±0.188、0.791±0.326,均P㧐0.05)。結論慢病毒介導的BAG-1L基因過表達可以降低缺氧引起的SH-SY5Y細胞損傷,抑制細胞凋亡;對細胞內HSP70、p-AKT蛋白表達具有顯著影響,即BAG-1L過表達可能通過上調HSP70的表達及促進PI3K/AKT通路的激活,進而對缺氧引起的神經細胞損傷具有一定的保護作用;可能從分子水平上為臨床上缺血性腦血管病的防治提供科學依據。
[Abstract]:Objective To investigate the protective effects of recombinant lentivirus - mediated bcl - 2 - associated athanogene - 1 ( BAG - 1 ) on hypoxia - induced apoptosis of human neuroblastomas ( SH - SYY ) cells . The expression of BAG - 1L protein was detected by Western Blot . The results showed that the expression levels of BAG - 1L after hypoxia for 8 h were significantly higher than those in other 2 groups ( P ? 0 . 01 ) ; the levels of apoptosis in the recombinant lentivirus group , the control group and the control group were significantly higher than those in other 2 groups ( P ? 0.01 ) .
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743

【參考文獻】

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本文編號：1930021