本文選題：膠質(zhì)瘤 + NDGA-P21　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：神經(jīng)膠質(zhì)瘤是指神經(jīng)上皮來源的腫瘤,以星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為主,也包括少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、混合性膠質(zhì)瘤等。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)分級標(biāo)準(zhǔn),膠質(zhì)瘤可分為四級。膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率位列第一,而其中位生存期不超過兩年。因其惡性程度極高,雖然膠質(zhì)瘤的發(fā)病率在各類腫瘤中排名并不靠前,但其致死率卻一直居于腫瘤致死率的前兩位。且膠質(zhì)瘤發(fā)病沒有明顯的年齡相關(guān)性,在2016年的美國年度癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告中,腦腫瘤已成為青少年階段致死率最高的腫瘤類型。過去十年,人們在腫瘤治療方面取得了很多進(jìn)展,放化療對膠質(zhì)瘤也可起到一定的限制作用,但膠質(zhì)瘤患者的五年生存率卻并沒有因此獲得很大提升。我們需要對膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)瘤的“土壤”有更多更貼切的認(rèn)識,也需要有更多可供選擇的方法參與到膠質(zhì)瘤的治療之中。目前膠質(zhì)瘤的治療方式主要集中在化療、放療以及盡量完全的手術(shù)切除膠質(zhì)瘤,而免疫治療作為新型的腫瘤治療方式,在應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的治療中尚方興未艾。去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NordihydroguaiareticAcid,NDGA)是一種天然化合物,提取自美洲沙漠的灌木三齒拉瑞爾(Larreatridentata),20世紀(jì)曾被廣泛用作抗氧化劑,并應(yīng)用于抵抗紫外線的治療中。在過去三十年的研究中,NDGA被發(fā)現(xiàn)具有抗病毒,抗血管新生等新的作用,并發(fā)現(xiàn)能夠?qū)Χ喾N腫瘤具有直接的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)室前期合成的NDGA同分異構(gòu)體Nordy (dl-NDGA)是一個(gè)手性酚類小分子,具有抑制多種腫瘤的功能。本實(shí)驗(yàn)室以NDGA的化學(xué)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)合成了新型小分子化合物NDGA-P21 (1,4-二(3, 4-二甲氧基苯基)-2, 3-二甲基-2, 3-環(huán)氧丁烷),相比于NDGA其主要的結(jié)構(gòu)改變是在碳鏈上添加一個(gè)氧原子,構(gòu)成環(huán)氧結(jié)構(gòu),從而增大其反應(yīng)活性,同時(shí)保持NDGA兩側(cè)的主要效應(yīng)基團(tuán),以保證新合成的小分子能夠具有相似的生物作用。本研究以細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 NDGA-P21具有與Nordy相似或更強(qiáng)的能力抵抗膠質(zhì)瘤增殖和抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新能力。腫瘤的發(fā)生并不僅僅是腫瘤細(xì)胞孤立活動的結(jié)果,腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展很大程度上跟它所處的環(huán)境有關(guān),Paget的“種子和土壤”學(xué)說(“seed and soil”)即提出了這個(gè)問題。而R.A.Weinberg在其2011年關(guān)于腫瘤特征的綜述中特別提出,與上一版他們提出的特征相比,近年的研究暴露了腫瘤的一個(gè)新特征,即其可以逃避免疫系統(tǒng)的追殺。腫瘤微環(huán)境,特別是腫瘤微環(huán)境中腫瘤特異性T細(xì)胞,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中被腫瘤細(xì)胞逐漸改造,直至“倒戈”。正常的T細(xì)胞能夠識別并殺傷非自體的抗原。而在腫瘤微環(huán)境中,盡管有些腫瘤具有腫瘤特異性的抗原,腫瘤特異性T細(xì)胞也不能行使其殺傷作用,這就是困擾人們許久的“Hellstrom悖論”(“Hellstromparadox”)。這個(gè)過程,有腫瘤細(xì)胞自身的直接作用,有被改造的抗原提呈細(xì)胞的輔助作用,也是T細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞改造的結(jié)果。出現(xiàn)變異的腫瘤細(xì)胞繞過了免疫系統(tǒng)的監(jiān)管,或是使效應(yīng)細(xì)胞耗竭失活,所以才能在機(jī)體內(nèi)不受控制地生長。由于血腦屏障的存在,人們長期以來認(rèn)為腦組織是免疫豁免的。然而,2016年Antoine Louveau等發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)也存在淋巴管及淋巴引流,這就為研究膠質(zhì)瘤局部的淋巴細(xì)胞浸潤提供了解剖基礎(chǔ)。同時(shí),隨著膠質(zhì)瘤發(fā)展,新生腫瘤血管的不連續(xù)性也為淋巴細(xì)胞突破血腦屏障,進(jìn)入膠質(zhì)瘤提供了可能。研究膠質(zhì)瘤局部淋巴細(xì)胞的浸潤情況對于這種惡性程度極高的腫瘤的認(rèn)識十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤病人的瘤體局部存在一種特別的T細(xì)胞,它能夠表達(dá)活化標(biāo)記CXCR5以及抑制性T細(xì)胞標(biāo)記PD-1,但這種細(xì)胞在外周循環(huán)的血液中卻并不存在。我們因此假設(shè)T細(xì)胞進(jìn)入膠質(zhì)瘤組織局部后,被膠質(zhì)瘤細(xì)胞馴化,從而出現(xiàn)了高表達(dá)PD-1的表型,并分泌IL-8等因子,使T細(xì)胞不能再繼續(xù)發(fā)揮其監(jiān)管殺傷作用,轉(zhuǎn)而開始為腫瘤細(xì)胞增殖及免疫逃逸提供了可能性。而這群特異性的Tfh樣T細(xì)胞也為膠質(zhì)瘤的免疫治療提供了新的可能的靶標(biāo)。主要結(jié)果和結(jié)論如下:一、 小分子藥物NDGA-P21對膠質(zhì)瘤的抑制作用1.通過不同濃度下體外給藥,以細(xì)胞計(jì)數(shù)法直接測算U87-MG細(xì)胞中藥物IC50:NDGA-P21—7.43μmol/L, Nordy—34.52μmol/L;原代膠質(zhì)瘤 GBM1 細(xì)胞中藥物 IC50:NDGA-P21—55.54μmol/L,Nordy — 15.38μmol/L。連續(xù)觀察各組 U87-MG 及 GBM1 細(xì)胞生長,細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定兩種細(xì)胞經(jīng)DMSO、NDGA-P21及Nordy處理后的增殖曲線,發(fā)現(xiàn)相比于DMSO對照組,NDGA-P21及Nordy可以抑制明顯膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖(P0.05 )。2.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),NDGA-P21可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期,而對凋亡并無明顯影響。NDGA-P21可明顯抑制G1-S期轉(zhuǎn)換過程中的CCNE1、CDK2、CDK6的mRNA表達(dá),并上調(diào)G2-M期的抑制性分子GADD45a的mRNA表達(dá)。說明NDGA-P21誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯。3. NDGA-P21可明顯抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的軟瓊脂克隆形成及成球能力(P0.05),并且抑制干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Nanog的mRNA表達(dá),說明NDGA-P21具有抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新的能力4.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)NDGA-P21可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表達(dá)已分化的膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP,從而說明NDGA-P21具有誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的能力。二、膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的輔助性T細(xì)胞(Tfh)樣T細(xì)胞浸潤1.通過對膠質(zhì)瘤患者瘤體組織局部淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測及膠質(zhì)瘤組織切片的免疫熒光分析,我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織局部浸潤有一群特異性高表達(dá)CXCR5及PD-1的T細(xì)胞,CXCR5與PD-1高表達(dá)被看作是次級淋巴結(jié)構(gòu)中Tfh的標(biāo)志分子,故稱之為Tfh樣T細(xì)胞。2.通過對比膠質(zhì)瘤組織內(nèi)浸潤T細(xì)胞和外周血中T細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)這群高表達(dá)CXCR5及PD-1的T細(xì)胞是具有組織特異性的,外周血中T細(xì)胞僅高表達(dá)CXCR5,而PD-1表達(dá)量卻普遍很低。3.通過膠質(zhì)瘤患者瘤體組織及外周血樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平測序分析,我們發(fā)現(xiàn)這群特異性T細(xì)胞的特征性基因群,并且通過分析特征基因群體性表達(dá)(CD3D,CD4,CXCR5, PD-1, IL1B,C1QB,FCERIG,IL1RN, FOSB,IL8, TREM2, CSF1, CCL3),發(fā)現(xiàn)Tfh樣T細(xì)胞的富集與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。4.通過小鼠原位膠質(zhì)瘤移植瘤模型,我們檢測了小鼠膠質(zhì)瘤腫瘤特異性T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)小鼠膠質(zhì)瘤中也存在一群Tfh樣T細(xì)胞。5.敲除Tfh細(xì)胞后小鼠膠質(zhì)瘤生長受到抑制,且T細(xì)胞耗竭標(biāo)記物Tim-3表達(dá)降低�？傊�,本文的主要結(jié)論為:NDGA衍生物NDGA-P21具有對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的直接抑制及對其自我更新能力的抑制的作用,從而對膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出良好的治療前景。膠質(zhì)瘤微環(huán)境中存在特異的Tfh樣CD4~+T細(xì)胞,且其在瘤體的富集程度與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)。本文從膠質(zhì)瘤的化療和免疫治療兩個(gè)方向入手,探索了對膠質(zhì)瘤治療的新方向。
[Abstract]:In the past decade , NDGA has been widely used as an antioxidant and has been used in the treatment of glioma . In the past decade , the NDGA isomer Nordy ( dl - NDGA ) has been widely used as an antioxidant and has been used in the treatment of glioma . The tumor microenvironment , especially tumor - specific T - cell in tumor microenvironment , has provided a new possibility for the tumor cell proliferation and immune escape . It was found that NDGA - P21 could inhibit the proliferation of glioma stem cells ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

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本文編號：1915253