本文選題：肝豆湯改良方 + TX小鼠��； 參考：《安徽中醫(yī)藥大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景 肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson病(Wilson’s disease, WD)，是一種常染色體隱性遺傳銅代謝障礙性疾病。臨床上以肝損害、神經(jīng)精神癥狀、錐體外系癥狀、角膜K-F環(huán)等為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重者可危及生命。但Wilson病是少數(shù)可以治療的神經(jīng)遺傳病之一。目前國內(nèi)外主要以青霉胺為代表的金屬螯合劑治療WD，有驅(qū)銅量高、顯著改善癥狀等優(yōu)點，但對已存在嚴(yán)重神經(jīng)癥狀的WD患者難以奏效。而本課題組所在單位通過近三十年研究發(fā)現(xiàn)肝豆湯治療WD有一定的效果，且在此基礎(chǔ)上的改良方治療腦型WD患者獲得了更好的效果。雖然我們發(fā)現(xiàn)肝豆湯改良方能減輕和恢復(fù)腦型WD患者的神經(jīng)精神癥狀，但其產(chǎn)生療效的確切機制尚不明確。本研究擬通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、免疫組織化學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）等技術(shù)，觀察肝豆湯對保護WD動物模型-TX小鼠神經(jīng)元損傷的信號調(diào)控機制，在分子水平初步闡明肝豆湯改善腦型WD患者臨床癥狀的療效機理。 研究目的 1.觀察肝豆湯改良方治療前后TX小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、血清Cu和腦組織Cu含量，以及腦組織病理學(xué)的改變，并探討其改變的可能機制。 2.觀察TX小鼠腦組織ASM、CER、JNK、P38的基因和蛋白表達水平，探討ASM、CER、JNK、P38在高銅誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷中作用，以及肝豆湯改良方調(diào)節(jié)上述蛋白可能參與的信號通路保護神經(jīng)元的機制，為肝豆湯改良方治療WD提供實驗理論依據(jù)。 研究方法 1.將180只TX小鼠隨機分為TX模型組、肝豆湯治療組、丁苯酞對照組，，同時選用60只DL小鼠做正常對照組，丁苯酞為陽性對照藥物。DL對照組飼養(yǎng)環(huán)境及喂食食物與治療組相同，每日分兩次予生理鹽水各0.2ml/10g/次灌胃，連續(xù)2～4月。TX模型組飼養(yǎng)環(huán)境及喂食食物與治療組相同，每日分兩次予生理鹽水各0.2ml/10g/次灌胃，連續(xù)2～4月。丁苯酞對照組TX小鼠喂食普通動物用顆粒飼料，丁苯酞每0.1g溶于12.5ml食用麻油中，配成混懸液，予丁苯酞80mg/kg的劑量進行灌胃治療，并根據(jù)小鼠重量按0.2ml/10g/次，每日分兩次予丁苯酞灌胃給藥，連續(xù)2～4月。肝豆湯治療組TX小鼠喂食普通動物用顆粒飼料，根據(jù)肝豆湯組方制備中藥肝豆湯，并根據(jù)小鼠重量按0.2ml/10g/次，每日分兩次予中藥肝豆湯灌胃給藥，連續(xù)2～4月。 2.觀察治療前后各組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分。 3.檢測各組小鼠治療前后血清Cu和腦組織Cu含量的變化，以及腦組織HE染色病理學(xué)的改變，觀察肝豆湯改良方對TX小鼠神經(jīng)元保護的作用。 4.應(yīng)用用免疫組化-DAB染色法和Western-Blot法檢測肝豆湯改良方治療后的TX小鼠腦組織ASM、Cer、P38、和JNK蛋白的表達水平，RT-PC技術(shù)檢測ASMmRNA、CermRNA、JNKmRNA、P38mRNA表達水平，并探討肝豆湯改良方調(diào)節(jié)上述蛋白參與腦損傷保護的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 實驗結(jié)果 1肝豆湯改良方對TX小鼠神經(jīng)元損傷相關(guān)的影響 1.1TX小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分較正常DL小鼠高，經(jīng)肝豆湯改良方治療后降低。 1.2TX模型組血清Cu含量較同月齡DL對照組均降低，1月齡（P＜0.05），3月齡和5月齡（P＜0.01）。經(jīng)肝豆湯改良方治療后，肝豆湯治療組較TX模型組血清Cu含量升高，治療3月（P0.05），治療5月（P＜0.01）；與DL對照組3月齡和5月齡比較，血清Cu含量低（P＜0.05）；與丁苯酞對照組比較血清銅含量低（P0.05）。 1.3TX模型組腦組織Cu含量較同月齡DL對照組升高，1月齡（P0.05），3月齡（P＜0.01），5月齡（P＜0.01）。肝豆湯治療后TX小鼠腦組織Cu含量較TX模型組降低，治療3月（P＜0.05），治療5月（P＜0.05）；與DL對照組腦組織Cu含量比較升高（P＜0.01）；較丁苯酞對照組降低（P0.05）。 1.4TX小鼠腦組織HE染色在高倍鏡下觀察：1月齡TX模型組腦組織可見少量神經(jīng)細(xì)胞間質(zhì)水腫，胞核濃染、固縮，3月齡和5月齡小鼠神經(jīng)細(xì)胞界限不清，細(xì)胞間距加大，有大量的深染、核固縮神經(jīng)元，散在少量的變性壞死神經(jīng)元；經(jīng)肝豆湯治療后，肝豆湯治療組神經(jīng)元損傷較TX模型組改善。 2肝豆湯改良方對銅誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的細(xì)胞內(nèi)外神經(jīng)酰胺級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機制 2.1免疫組化法檢測ASM、Cer、JNK、P38表達：1）各蛋白陽性表達為棕黃色，ASM、Cer、P38在TX模型組及各治療組均可見陽性細(xì)胞表達，TX模型組陽性表達較其他各組均顯著增強（P0.01）；相同月齡肝豆湯治療組腦組織各蛋白陽性表達較丁苯酞對照組稍高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。2）JNK在DL對照組、TX模型組及各治療組均可見陽性細(xì)胞表達，但JNK在TX模型組陽性表達較其他各組無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。 2.2RT-PCR檢測各組TX小鼠腦組織中ASMmRNA、CermRNA、JNKmRNA、P38mRNA表達：ASMmRNA、CermRNA、P38mRNA在TX模型組表達較其他組增多，3月齡和5月齡都有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；JNKmRNA TX模型組較其他組無明顯差異。 2.3Western-Blot法檢測ASM、Cer、P38、JNK蛋白的表達：各蛋白水平在TX模型組較DL對照組表達量顯著增強（P0.01）；治療3月時，肝豆湯治療組、丁苯酞對照組與TX模型組比較，陽性蛋白相對表達量下降（P0.05），治療5月時，陽性蛋白相對表達量明顯下降（P0.01）；肝豆湯治療組腦組織各陽性蛋白相對表達量較丁苯酞對照組稍高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論 1.銅在TX小鼠腦組織的過度蓄積，可引起TX小鼠神經(jīng)行為學(xué)異常和腦組織損傷的表現(xiàn)。 2.銅負(fù)荷可誘導(dǎo)TX小鼠腦組織中神經(jīng)酰胺信號通路激活引起腦細(xì)胞損傷。 3.肝豆湯改良方可以降低TX小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分。 4．肝豆湯改良方可以降低腦組織Cu含量，是其改善腦組織損傷的主要原因。 5.肝豆湯改良方能夠下調(diào)TX小鼠腦組織中ASM、Cer、P38、JNK等蛋白的磷酸化水平，是改善腦組織損傷的重要原因。 6.肝豆湯改良方改善腦組織損傷與丁苯酞有相似的療效，但其作用機制不同，為臨床治療WD提供一定的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 王共強;王偉;薛本春;胡文彬;胡紀(jì)源;韓詠竹;;Wilson病中醫(yī)證候文獻分析[J];安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年04期

2 洪銘范,胡紀(jì)原,胡文彬,楊任民;肝豆?fàn)詈俗冃缘闹嗅t(yī)辨證分型[J];安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1998年01期

3 胡慧;王平;胡亞萍;石和元;孔明望;劉萍;;溫膽湯改良方對Alzheimer病細(xì)胞模型JNK、c-jun磷酸化水平的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2008年01期

4 焦先婷;劉曉青;黃麗素;張擁軍;韓連書;;Caspase-3,-8,-9在銅誘導(dǎo)大鼠原代皮層神經(jīng)元凋亡中的作用研究[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2009年11期

5 楊文明;韓輝;鮑遠(yuǎn)程;汪瀚;謝道俊;汪美霞;張波;陳懷珍;;中醫(yī)對肝豆?fàn)詈俗冃圆∫虿C及辨證論治的探索[J];北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(中醫(yī)臨床版);2012年04期

6 曹亮 ,劉康永 ,趙蕾蕾;中西醫(yī)結(jié)合治療肝豆?fàn)詈俗冃耘R床觀察[J];上海中醫(yī)藥雜志;2003年09期

7 石元洪;洪永春;楊任民;胡紀(jì)源;;肝細(xì)胞體外培養(yǎng)對肝豆湯排銅作用的拆方研究[J];陜西中醫(yī);2006年09期

本文編號：1869411