發(fā)布時(shí)間：2018-05-09 06:59

  本文選題：朊病毒病 + 朊病毒　； 參考：《中國疾病預(yù)防控制中心》2017年博士論文

【摘要】：阮病毒病(prion diseases),是一類侵襲人類及多種動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性腦病,潛伏期長,100%致死率。人類的朊病毒病包括克雅氏病(CJD)、致死性家族性失眠癥(FFI)、庫魯病(Kuru)、吉斯特曼-施特勞斯綜合征(GSS)等。其中克雅氏病分為散發(fā)型克雅氏病(sCJD)、遺傳型克雅氏病(gCJD)、醫(yī)源型克雅氏病(iCJD)、以及變異型克雅氏病(vCJD)。朊病毒病的感染因子是朊病毒,這是一種不含有核酸、具有自我復(fù)制能力的感染性蛋白。朊病毒是由體內(nèi)正常表達(dá)的具有GP1錨的朊蛋白(PrpC)發(fā)生錯(cuò)誤折疊,變?yōu)橹虏⌒问诫貌《?PrPSc)。PrPC與PrPSc的氨基酸序列完全相同,只是二級結(jié)構(gòu)不同。目前朊病毒病確診診斷需要在腦組織中發(fā)現(xiàn)PrPSc,但腦組織不容易獲得。我國絕大部分患者是根據(jù)臨床表現(xiàn)、臨床檢測以及實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果做出臨床克雅氏病診斷。因此需要一種使用其他組織或體液的方法來檢測PrPSc,做出準(zhǔn)確診斷。實(shí)時(shí)震動(dòng)誘導(dǎo)蛋白擴(kuò)增(RT-QuIC)方法利用PrPSc能夠誘導(dǎo)PrPC轉(zhuǎn)化的特點(diǎn),在體外通過不斷的震蕩-孵育循環(huán),使PrPSc大量擴(kuò)增,并通過硫黃素T(ThT)實(shí)時(shí)反映PrPSc的量。RT-QuIC方法具有高通量,高速度,靈敏度高,特異型高等特點(diǎn)。有報(bào)道RT-QuIC能夠檢測腦脊液中的PrPSc。相比腦組織檢測,更容易被患者接受。因此RT-QuIC方法對克雅氏病的診斷具有十分重要的意義。目前我國還沒有關(guān)于RT-QuIC的報(bào)道。在本研究中,我們首次建立了基于重組倉鼠PrP23-231片段的RT-QuIC方法,該方法能夠從1μl 10-8稀釋度的倉鼠263K腦勻漿中檢測出PrPSc。同時(shí)我們對幾種可能影響RT-QuIC方法的因素進(jìn)行探索。我們發(fā)現(xiàn) lxPBS,170mM 氯化鈉(NaCl),1OOmM EDTA,10μM ThT,lng SDS,10μg重組蛋白以及10μl的腦脊液體積是更加理想的RT-QuIC條件。應(yīng)用RT-QuIC方法,我們探索不同朊病毒毒株的反應(yīng)特點(diǎn)。在毒株準(zhǔn)備上,除了實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擁有263K倉鼠毒株,139A、ME7小鼠毒株,以及SMB-S15細(xì)胞。我們還試圖制備SMB-S15細(xì)胞染毒小鼠毒株。我們使用S15細(xì)胞去染毒不同品系(CD1、Balb/C、C57)小鼠,經(jīng)過大約170天左右,所有染毒小鼠均表現(xiàn)出了朊病毒病。通過對腦組織切片檢測,也發(fā)現(xiàn)了典型的神經(jīng)病理學(xué)改變。用三種小鼠腦組織繼續(xù)染毒下一代,其潛伏期縮短為150天左右。結(jié)果表明本研究成功獲得了三種S15細(xì)胞染毒的小鼠毒株。不同毒株的RT-QuIC反應(yīng)性不同。首先對于我們的RT-QuIC反應(yīng),由于使用了倉鼠重組PrP23-231片段,因此263K倉鼠來源毒株的反應(yīng)效率是最好的,優(yōu)于小鼠來源和細(xì)胞來源;其次,同樣是S15細(xì)胞來源的腦組織和細(xì)胞勻漿比較,動(dòng)物腦組織的反應(yīng)效率要優(yōu)于細(xì)胞勻漿。我們使用RT-QuIC方法還對不同朊病毒病患者腦脊液的反應(yīng)特點(diǎn)進(jìn)行了探索。首先是散發(fā)型克雅氏病。我們對70例克雅氏病臨床診斷患者,以及48例不支持克雅氏病診斷患者的腦脊液樣本進(jìn)行了檢測�？搜攀喜∨R床診斷患者顯示出了更高的陽性率(57.14%),同時(shí)在更早的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)熒光值升高(50小時(shí)內(nèi)),更高的最大熒光強(qiáng)度(大于25000 rfu)。與之對比,不支持克雅氏病診斷患者中只有少數(shù)樣本結(jié)果陽性,并且熒光值升高的時(shí)間在50小時(shí)之后,最大熒光強(qiáng)度在25000 rfu以內(nèi)。在我國最常見的三種遺傳型克雅氏病分別是FFI、T188K突變、以及E200K突變。這三種遺傳型克雅氏病的臨床表現(xiàn)、臨床檢查結(jié)果、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、以及神經(jīng)病理學(xué)都有明顯的不同。在本研究中,我們還探索了這三種遺傳型克雅氏病患者腦脊液在RT-QuIC上的反應(yīng)特性。我們總共檢測了 24例FFI、25例T188K以及16例E200K患者的樣本。其中16.7%的FFI、52%的T188K、以及62.5%的E200K表現(xiàn)出RT-QuIC反應(yīng)陽性結(jié)果。通過計(jì)算陽性結(jié)果的熒光值上升時(shí)間和最大熒光強(qiáng)度,我們發(fā)現(xiàn)E200K擁有最早的熒光值上升時(shí)間,以及最大的熒光強(qiáng)度,其次為T188K,而FFI樣本則表現(xiàn)出非常低的RT-QuIC反應(yīng)性。另外統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示RT-QuIC的陽性結(jié)果與14-3-3蛋白、腦部核磁以及腦電圖有明顯的相關(guān)性。通過本研究,建立了我國第一個(gè)RT-QuIC方法。該方法可以應(yīng)用于不同朊病毒毒株的PrPSc檢測,同時(shí)也能夠?qū)Σ煌貌《静』颊吣X脊液中的PrPSc進(jìn)行檢測。對未來我國克雅氏病的監(jiān)測診斷有重大意義。
[Abstract]:In this study , PrPSc can be detected by RT - Quic method , which is characterized by high flux , high speed , high sensitivity and high specificity . The results showed that the reaction efficiency of three kinds of brain tissue was better than that of mouse source and cell . The results showed that the reaction efficiency of different strains was better than that of mouse source and cell . In this study , we found that E200K has the earliest fluorescence value rise time and the maximum fluorescence intensity , and the maximum fluorescence intensity , followed by T188K , and E200K mutation . In this study , we have found that E200K has the earliest fluorescence value rise time and the maximum fluorescence intensity .

【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742.9

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本文編號：1865037