本文選題：Rbfox1 + 癲癇　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的：探索皮質(zhì)發(fā)育障礙伴難治性癲癇患者腦內(nèi)病灶組織中RBFOX1蛋白的表達(dá)情況；采用慢病毒介導(dǎo)的Rbfox1基因過(guò)表達(dá)和沉默技術(shù)，建立離體培養(yǎng)的大鼠原代神經(jīng)元Rbfox1基因過(guò)度表達(dá)與沉默模型，研究不同水平的Rbfox1蛋白對(duì)神經(jīng)元興奮性的影響及可能機(jī)制。 方法：收集皮質(zhì)發(fā)育障礙伴難治性癲癇患者腦內(nèi)病灶組織（本實(shí)驗(yàn)取顳葉皮質(zhì)為研究對(duì)象），對(duì)照組為重型顱腦外傷患者因顱內(nèi)壓高行內(nèi)減壓術(shù)切除的非挫傷區(qū)的顳葉皮質(zhì)。采取免疫組化和Western blot技術(shù)檢測(cè)皮質(zhì)發(fā)育障礙伴難治性癲癇患者腦內(nèi)病灶組織中RBFOX1蛋白的表達(dá)情況。 采取慢病毒介導(dǎo)的Rbfox1基因過(guò)表達(dá)和沉默技術(shù)制備原代神經(jīng)元Rbfox1基因過(guò)表達(dá)與沉默模型，采用RT-qPCR技術(shù)、Western blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染效率。采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)Rbfox1基因表達(dá)改變后原代神經(jīng)元的興奮性改變。同時(shí)采用Western blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Rbfox1基因表達(dá)改變后原代神經(jīng)元內(nèi)Rbfox1蛋白的下游靶基因包括NMDA受體1(Grin1), GABA-A受體γ2(Gabrg2)和鈉通道Na(v)1.6(Scn8a)基因表達(dá)的改變。 結(jié)果：在皮質(zhì)發(fā)育障礙伴難治性癲癇患者腦內(nèi)病灶組織中，RBFOX1蛋白表達(dá)上調(diào)。膜片鉗技術(shù)檢測(cè)Rbfox1蛋白表達(dá)水平不同的神經(jīng)元興奮性時(shí)發(fā)現(xiàn)：1.Rbfox1過(guò)表達(dá)組的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢环群外c電流密度值較Rbfox1沉默組、空病毒組以及對(duì)照組都顯著增高，，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.僅我們做膜片鉗觀察的有限時(shí)間內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)26.32%的Rbfox1過(guò)表達(dá)組神經(jīng)元出現(xiàn)了自發(fā)的、反復(fù)發(fā)生的癲癇樣放電。3.Rbfox1沉默組的神經(jīng)元也表現(xiàn)出類似的結(jié)果，但不及Rbfox1過(guò)表達(dá)組明顯。Rbfox1過(guò)表達(dá)組神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢徊ǚ萊bfox1沉默組神經(jīng)元增高近9mV，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05, ANOVA繼之以LSDtest)；Rbfox1過(guò)表達(dá)組出現(xiàn)自發(fā)的癲癇樣放電的神經(jīng)元比例比Rbfox1沉默組增高約10%，癲癇樣放電的頻率也明顯增高。4.一些與癲癇有關(guān)的Rbfox1蛋白的靶基因蛋白產(chǎn)物隨著原代神經(jīng)元內(nèi)Rbfox1蛋白表達(dá)的改變（上調(diào)以及下調(diào)）而出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，包括NMDA受體1(Grin1),GABA-A受體γ2(Gabrg2)以及鈉通道Na(v)1.6(Scn8a)。 結(jié)論：1.皮質(zhì)發(fā)育障礙伴難治性癲癇患者的腦內(nèi)病灶組織中RBFOX1蛋白表達(dá)顯著增高；過(guò)表達(dá)Rbfox1蛋白的神經(jīng)元興奮性比Rbfox1表達(dá)抑制以及對(duì)照組的神經(jīng)元都顯著增高，提示Rbfox1蛋白表達(dá)上調(diào)可能參與了調(diào)控神經(jīng)元的興奮性，可能參與了癲癇的發(fā)病。2.過(guò)表達(dá)Rbfox1蛋白的神經(jīng)元興奮性增高可能與SNAP-25，鈉通道Na(v)1.6，NMDA受體1等和細(xì)胞興奮性有關(guān)的蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
[Abstract]:Objective: to investigate the expression of RBFOX1 protein in brain tissue of patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy, and to investigate the expression and silencing of Rbfox1 gene mediated by lentivirus. In order to study the effect of different levels of Rbfox1 protein on neuronal excitability and its possible mechanism, a model of overexpression and silencing of Rbfox1 gene in primary neurons in vitro was established to study the effects of different levels of Rbfox1 protein on neuronal excitability. Methods: the focal tissues of cerebral lesions in patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy were collected. In this experiment, the temporal lobe cortex was selected as the study object, and the control group was the temporal cortex of the non-contusive area in the severe craniocerebral trauma patients which had been resected by internal decompression due to intracranial hypertension. Immunohistochemical and Western blot techniques were used to detect the expression of RBFOX1 protein in brain tissue of patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy. The lentivirus-mediated overexpression and silencing of Rbfox1 gene were used to prepare the primary neuron model of Rbfox1 gene overexpression and silencing. The efficiency of lentivirus transfection was verified by RT-qPCR technique, Western blot technique and immunofluorescence technique. Patch clamp technique was used to detect the excitability of primary neurons after the change of Rbfox1 gene expression. At the same time, Western blot and immunofluorescence techniques were used to detect the downstream target genes of Rbfox1 protein in primary neurons, including NMDA receptor 1, GABA-A receptor 緯 2, Gabrg2, and sodium channel, Nav 1. 6, Scn8a). Results: the expression of RBFOX1 protein was up-regulated in the lesions of patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy. Patch clamp technique was used to detect the excitability of neurons with different expression levels of Rbfox1 protein. It was found that the amplitude of action potential and sodium current density of neurons in the overexpression group of Rbfox1 were significantly higher than those in the Rbfox1 silencing group, the empty virus group and the control group. The difference was statistically significant. Only in the limited time we did patch clamp observation, we found that 26.32% of neurons in the Rbfox1 overexpression group showed spontaneous and recurrent epileptic discharges. 3. The neurons in the Rbfox1 silencing group showed similar results. But the amplitude of action potential of neurons in the overexpression group of Rbfox1 was 9 MV higher than that in the group of Rbfox1 silencing, and the difference was statistically significant (P 0.05). The frequency of spontaneous epileptiform discharges in ANOVA group was higher than that in the group with Rbfox1 overexpression. Compared with Rbfox1 silencing group, the frequency of epileptiform discharge was increased by 10% and 4. 4% respectively. The target protein products of some Rbfox1 proteins associated with epilepsy were up-regulated with the changes (up-regulation and down-regulation) of Rbfox1 protein expression in primary neurons, including the expression of GABA-A receptor 緯 _ 2GABA-A receptor 緯 _ 2Gabrg _ 2 and sodium channel Na _ (v) ~ (1.6) / Scn _ (8aN) in primary neurons. Conclusion 1. The expression of RBFOX1 protein in brain lesions of patients with cortical dysplasia and intractable epilepsy was significantly increased, the excitability of neurons overexpression of Rbfox1 protein was significantly higher than that of Rbfox1 expression inhibition and the neurons of control group were significantly higher than those of control group. These results suggest that the up-regulation of Rbfox1 protein may be involved in the regulation of neuronal excitability, and may be involved in the pathogenesis of epilepsy. The increase of neuronal excitability of overexpression of Rbfox1 protein may be related to the up-regulation of SNAP-25, Na ~ + channel Navn ~ (1.6) NMDA receptor _ 1 and protein expression related to cell excitability.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.1

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本文編號(hào)：1861746