本文選題：人多能干細胞 + 神經(jīng)分化　； 參考：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：神經(jīng)退行性疾病是一類慢性、漸進性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,嚴重威脅人類的健康。隨著人口老齡化的加劇,神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率將會進一步增加。常見的神經(jīng)退行性疾病有帕金森疾病,阿爾茲海默病和亨廷頓疾病等。這類疾病以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元漸進性變性、死亡為特征。例如,帕金森疾病的發(fā)病原因是中腦黑質(zhì)區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)元(Dopaminergic neuron,DA)受損或者死亡,阿爾茲海默病是基底前腦膽堿能神經(jīng)元(basal forebrain cholinergic neurons,BFCN)變性,而亨廷頓疾病是紋狀體區(qū)GABA能投射神經(jīng)元(γ-Aminobutyric acid-ergic projection neuron,GABA)變性或死亡。目前臨床上對這類疾病的治療主要以補充神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)營養(yǎng)因子為主,沒有有效的診治措施來治療這類神經(jīng)退行性疾病。當(dāng)受損的神經(jīng)元無法繼續(xù)存活之后,這些傳統(tǒng)的治療方法將無法繼續(xù)緩解相應(yīng)的病癥。通過細胞移植的方法,重新恢復(fù)缺損的神經(jīng)回路將是治療這些疾病的唯一有效途徑,而隨著干細胞的發(fā)現(xiàn)以及研究的不斷深入,細胞移植療法會在治療神經(jīng)退行性疾病中得到更加廣泛的應(yīng)用。目的在將人多能干細胞(Human pluripotent stem cell,h PSC)應(yīng)用在個體發(fā)育和疾病研究的過程中,關(guān)鍵是構(gòu)建合適的分化系統(tǒng)誘導(dǎo)多能干細胞體外分化形成特定的神經(jīng)前體細胞和神經(jīng)元。理想的體外分化系統(tǒng)應(yīng)該是化學(xué)成分確定的、高效的、對所分化的細胞類型能加以調(diào)控的,并且能夠完全反映體內(nèi)分化發(fā)育的相關(guān)機制。目前體外誘導(dǎo)h PSC神經(jīng)分化的系統(tǒng)主要包括兩類:懸浮分化系統(tǒng)(Embryoid body(EB)formation differentiation paradigm)和貼壁分化系統(tǒng)(Adherent culture(AD)differentiation paradigm)。多項實驗研究報道通過這兩種分化系統(tǒng)成功誘導(dǎo)h PSC分化形成內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起(medial ganglionic eminence,MGE)、外側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起(Lateral ganglionic eminence,LGE)和基板(Floor plate,FP)。而這些部位的神經(jīng)前體細胞移植后繼續(xù)分化形成的功能性GABA能中間神經(jīng)元、BFCN以及中腦DA神經(jīng)元可對癲癇、阿爾茨海默病、亨廷頓疾病和帕金森疾病的癥狀有很好的改善。但是這兩類系統(tǒng)對分化成為各類神經(jīng)元是普遍適用的還是具有特異性,目前尚不清楚。方法1.優(yōu)化EB分化系統(tǒng)和AD分化系統(tǒng)將h PSC分化形成神經(jīng)前體細胞和神經(jīng)元。2.在EB分化系統(tǒng)和AD分化系統(tǒng)中將神經(jīng)外胚層(Neural-ecoderm,NE)細胞通過腹側(cè)化誘導(dǎo)分子SHH(Sonic Hedgehog)和尾側(cè)化誘導(dǎo)分子RA(Retinoic acid)靶向為不同部位神經(jīng)前體細胞。3.系統(tǒng)比較EB分化系統(tǒng)和AD分化系統(tǒng),觀察兩種分化系統(tǒng)對不同部位神經(jīng)前體細胞和亞型特異性神經(jīng)元分化的選擇性。4.通過m RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組的分析研究EB分化系統(tǒng)和AD分化系統(tǒng)導(dǎo)致神經(jīng)前體細胞和神經(jīng)元譜系分化差異的具體機制。5.在hPSC系統(tǒng)中建立基因敲除和基因誘導(dǎo)過表達轉(zhuǎn)基因體系,通過轉(zhuǎn)基因細胞系,研究不同分化系統(tǒng)對神經(jīng)元譜系分化選擇性的具體機制。6.通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建Foxa2-2-e GFP報告細胞系,利用小分子化合物篩選,在EB和AD分化系統(tǒng)中實現(xiàn)細胞譜系分化的調(diào)控。結(jié)果1.在無外源誘導(dǎo)分子的條件下,優(yōu)化后的EB分化系統(tǒng)和AD分化系統(tǒng)都可以高效的誘導(dǎo)h PSC分化形成Foxg1+/Pax6+的前腦背側(cè)神經(jīng)前體細胞和Tuj1+/Tbr1+/VGlu T1+的背側(cè)神經(jīng)元。2.在EB分化系統(tǒng)和AD分化系統(tǒng)中,SHH可誘導(dǎo)h PSC分化形成Pax6-/Nkx2.1+的腹側(cè)神經(jīng)前體細胞;RA可誘導(dǎo)細胞分化形成Foxg1-/Hoxb4+的后腦神經(jīng)前體細胞。3.在EB和AD分化系統(tǒng)中,SHH誘導(dǎo)h PSC腹側(cè)化之后,EB分化系統(tǒng)產(chǎn)生Nkx2.1+/Sox1+/Lhx6+/Lhx8+/Foxa2-/Foxg1+/EN1-的MGE細胞,分化形成的神經(jīng)元以GABA陽性的中間神經(jīng)元和CHAT陽性神經(jīng)元為主,而AD分化系統(tǒng)得到的是Nkx2.1+/Sox1-/Lhx6-/Lhx8-/Foxa2+/Foxg1-/EN1+的FP細胞,主要分化形成TH陽性神經(jīng)元。4.m RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組的分析顯示EB和AD分化系統(tǒng)中早期分化細胞中在發(fā)育相關(guān)基因的表達、能量代謝和細胞粘附等多方面的差別決定了不同神經(jīng)前體細胞和神經(jīng)元亞型分化命運之間的差別。5.通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的Foxg1誘導(dǎo)過表達以及Foxa2、Pax6和Nkx2.1敲除的胚胎干細胞系分化后都不會改變干細胞在兩個分化系統(tǒng)之間不同的分化命運。6.通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的Foxa2e GFP/W人胚胎干細胞系,結(jié)合小分子化合物篩選實驗,篩選出JAK2-STAT3信號通路抑制劑AG490和p38 MAPK信號通路抑制劑SB202190可實現(xiàn)FP和MGE分化命運以及相應(yīng)神經(jīng)元亞型之間的轉(zhuǎn)換。結(jié)論本實驗通過實驗證實h PSC利用EB分化系統(tǒng)和AD分化系統(tǒng)進行體外神經(jīng)分化的過程中,在沒有任何外源誘導(dǎo)分子的條件下,分化得到的都是前腦背側(cè)部的神經(jīng)前體細胞。在分化系統(tǒng)中加入激活Shh信號通路之后,h PSC在EB分化系統(tǒng)和AD分化系統(tǒng)都能被誘導(dǎo)產(chǎn)生Pax6-/Nkx2.1+的腹側(cè)化細胞,但是在兩種分化系統(tǒng)中形成的卻并不是同一種細胞類型。EB分化系統(tǒng)的細胞經(jīng)過SHH誘導(dǎo)后形成的是MGE的神經(jīng)前體細胞,經(jīng)過進一步的神經(jīng)分化形成GABA和CHAT陽性的神經(jīng)元;AD分化系統(tǒng)的細胞在SHH誘導(dǎo)之后分化得到的是FP的神經(jīng)前體細胞,主要分化形成TH陽性的神經(jīng)元。本研究還通過構(gòu)建Foxa2的e GFP細胞系來進行小分子化合物的篩選,發(fā)現(xiàn)JAK2-STAT3和p38 MAPK信號通路在FP的分化發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用。使用小分子抑制劑AG490和SB202190抑制分化過程中這兩個信號通路的活性,可使細胞的分化命運由原來的FP變成MGE,并進一步促進神經(jīng)元亞型之間的轉(zhuǎn)變。
[Abstract]:Neurodegenerative diseases are a kind of chronic , progressive nervous system disease , which seriously threatens the health of human beings . As the aging of the population increases , the incidence of neurodegenerative diseases will be increased further . Several experimental studies reported successful induction of h PSC differentiation by these two differentiation systems to form medial ganglionic uplift ( MGE ) , lateral ganglia bulge ( LGE ) , and basal plate ( FP ) . In the EB and AD differentiation systems , the differentiation of neural precursor cells and neurons in the neural precursor cells and neurons in different regions was investigated .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741

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本文編號：1857179