本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 + 神經(jīng)病理性疼痛�。� 參考：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景:神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain, NPP)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,傳統(tǒng)的抗炎藥、鈣離子通道拮抗劑、三環(huán)類抗抑郁藥等,在NPP的治療中非常局限,這使得NPP的治療成為臨床上亟待解決的問題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)因其獨(dú)特的生物學(xué)特點(diǎn)和優(yōu)勢如:增殖率高、遺傳穩(wěn)定、低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)作用等特點(diǎn),而直接用于神經(jīng)病理性疼痛等疾病的治療。但BMMSCs發(fā)揮治療作用的機(jī)制尚不明確。研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia, MG)在微量促炎因子作用下即可活化,活化后的MG可釋放大量主導(dǎo)NPP發(fā)生與進(jìn)展的炎性介質(zhì)。因此,調(diào)節(jié)MG過度活化成為治療NPP的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可被移植微環(huán)境中的促炎因子激活,通過自身旁分泌功能抑制MG過度活化進(jìn)而減輕NPP的發(fā)展。但目前促炎因子預(yù)處理BMMSCs作用于NPP的研究較少。因此,研究預(yù)處理BMMSCs在NPP的發(fā)病過程中的作用具有重要意義。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討TNF- α預(yù)處理的BMMSCs對CCI大鼠鎮(zhèn)痛作用及可能機(jī)制實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:1、培養(yǎng)并鑒定BMMSCs。2、體外情況下TNF- α預(yù)處理BMMSCs對其抑制MG活化作用的影響3、鞘內(nèi)注射經(jīng)TNF-α預(yù)處理的BMMSCs對CCI大鼠MG活化及疼痛行為的影響實(shí)驗(yàn)方法:1、采用貼壁分離法從雄性SD大鼠(3-4周齡)的股骨中分離BMMSCs。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物對所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。2、選擇雄性SD大鼠(6-8周齡)120只,參照Bennett法制備CCI模型,隨機(jī)分為3組(n=40);①CCI組(A組):造模后第7天鞘內(nèi)注射不含BMMSCs的PBS 20 μl;②BMMSC移植組(B組):造模后第七天鞘內(nèi)注射含BMMSCs(1×106/只)的PBS20μl;③TNF-α預(yù)處理BMMSCs組(C組):造模后第七天鞘內(nèi)注射含TNF-α處理后的BMMSCs (1×106/只)的PBS20μl。3、觀察各組大鼠在手術(shù)前1天,術(shù)后第3、7、14、21、28天PWL、PWT。4、分別于手術(shù)前一天,術(shù)后第3、7、14、21、28天采用頸椎脫臼法處死大鼠,分別取大鼠脊髓(SL)、腰段背根神經(jīng)節(jié)(DRG)。采用ELISA技術(shù)檢測SL、DRG內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10炎性因子水平;分別于術(shù)后14天取SL、DRG,采用免疫熒光技術(shù)檢測SL、DRG小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD68的表達(dá)水平。5、為進(jìn)一步驗(yàn)證BMMSCs對小膠質(zhì)細(xì)胞的影響,體外情況下采用LPS誘導(dǎo)MG活化,采用共培養(yǎng)的方法來檢測BMMSCs對LPS活化后的MG的作用。利用含1000ng/ml的TNF-α完全培養(yǎng)液對BMMSCs進(jìn)行預(yù)處理;利用LPS (10μg/ml)誘導(dǎo)大鼠MG活化。MG分離純化后,以1x105/孔種植于6孔板中,按以下分組將MG和BMMSCs進(jìn)行共培養(yǎng)24h。B組(單純BMMSCs組)、L+B 組(LPS+ BMMSCs 組)、T+B 組(TNF-α 預(yù)處理 BMMSCs 組)、L+T+B 組(LPS+TNF- α 預(yù)處理 BMMSCs 組)、M 組(單純 MG 組)、L+M 組(LPS+MG 組)、B+L+M 組(BMMSCs+LPS+MG 組)、T+B+L+M 組(TNF-α預(yù)處理 BMMSCs +LPS+MG 組)。6、24h后,取培養(yǎng)液上清,采用ELISA技術(shù)檢測上清液中TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子表達(dá)含量,免疫熒光法檢測MG表面標(biāo)記物CD68抗體的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、采用貼壁分離法培養(yǎng)的BMMSCs,隨著細(xì)胞不斷傳代純化,細(xì)胞形態(tài)呈長梭狀且呈旋渦狀排列,細(xì)胞表型鑒定結(jié)果如下:CD29表達(dá)率99.59%,CD90表達(dá)率83.95%,呈陽性;CD34表達(dá)率0.1%, CD45表達(dá)率7%,呈陰性。2、與CCI組、單純BMMSC組相比,TNF-α預(yù)處理BMMSCs組術(shù)前1天、術(shù)后28天PWT和PWL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);在術(shù)后第3天PWT和PWL逐漸降低,術(shù)后第7天降至最低,之后緩慢升高,于術(shù)后28天恢復(fù)至基線水平,在此期間TNF-α預(yù)處理BMMSCs術(shù)后7、14、21天PWT、PWL值均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。肉眼可見TNF-α預(yù)處理BMMSCs組大鼠精神狀態(tài)好,術(shù)側(cè)傷口恢復(fù)較快;與CCI組和單純BMMSC組相比,差異顯著。3、BMMSCs移植后進(jìn)行ELISA檢測發(fā)現(xiàn):TNF- α預(yù)處理BMMSCs組腰段脊髓、腰段背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)TNF-α、IL-6等促炎因子含量在術(shù)后第3、7天明顯升高,術(shù)后第14、21天促炎因子含量逐漸降低,術(shù)后28天促炎因子含量達(dá)到基線水平,與CCI組和單純BMMSC組相比,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。然而,TNF-α預(yù)處理BMMSCs組腰段脊髓、腰段背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)抑炎因子IL-10在術(shù)后第3、7表達(dá)呈低水平,在術(shù)后第14天逐漸上升,21天達(dá)到高峰,術(shù)后28天基本降至術(shù)前水平,與CCI組和單純BMMSC組相比,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)4、與CCI組和單純BMMSC組相比,SL、DRG中小膠質(zhì)細(xì)胞CD68表達(dá)水平明顯降低(p0.05),而CD68在CCI組和單純BMMSC表達(dá)無明顯變化。5、L+M組小膠質(zhì)細(xì)胞的CD68表達(dá)增高,分泌TNF-cα、IL-6含量明顯增多;B+L+M組以及T+B+L+M組的小膠質(zhì)細(xì)胞CD68表達(dá)水平、TNF- α、IL-6分泌量低于L+M組,且B+L+M組與T+B+L+M組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1、BMMSCs移植調(diào)節(jié)CCI大鼠的疼痛行為,發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,經(jīng)TNF-α預(yù)處理BMMSCs鎮(zhèn)痛效果更強(qiáng)。2、體外實(shí)驗(yàn)下,BMMSCs和經(jīng)TNF- α預(yù)處理的BMMSCs均可抑制LPS誘發(fā)的MG的活化且經(jīng)TNF-α預(yù)處理后的BMMSCs對MG活化的抑制作用更強(qiáng)。3、經(jīng)TNF- α預(yù)處理BMMSCs可抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化并降通過低促炎因子水平、提高抑炎因子水平來減緩CCI大鼠的疼痛行為。
[Abstract]:Objective : To study the effects of pre - treatment of BMMSCs on the activation of MG in rats . The expression levels of TNF - 偽 , IL - 6 , IL - 10 and IL - 10 were measured by ELISA . The expression of TNF - 偽 , IL - 6 , IL - 10 in the supernatant was determined by ELISA . Compared with the CCI group and the simple BMMSC group , the levels of CD68 , TNF - 偽 and IL - 6 in the spinal cord and lumbar spinal dorsal root ganglia were significantly lower than those in the CCI group and the simple BMMSC group ( P < 0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R741

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本文編號(hào)：1845283