本文選題：迷迭香酸 + 小鼠　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：隨著我國人口老齡化進(jìn)程的加速，腦血管�。X卒中）已成為危害人類健康和生命的主要疾病。缺血性腦血管病最常見，且其復(fù)發(fā)率、致殘率高居不下，給社會造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 腦是一個(gè)對缺氧最敏感的器官，腦重量僅占人體重量之2％，腦耗氧量卻占人體總耗氧量的20％。腦組織發(fā)生缺血后早期、及時(shí)、有效的恢復(fù)血供是治療的關(guān)鍵，組織纖溶酶原激活劑（tissue plasminogenactivator，tPA）是迄今為止美國食品和藥物管理局FDA批準(zhǔn)的、用于急性缺血卒中治療的首選藥物。然而，缺血腦組織實(shí)現(xiàn)血流再通的同時(shí)帶來的再灌注損傷一直困擾著臨床的治療和預(yù)后。腦缺血及再灌注損傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜，認(rèn)為存在多種機(jī)制相互作用形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括炎癥損害、自由基損傷、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等，直接/間接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡/死亡，血腦屏障破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能的缺失，甚至危及患者生命。 因此，積極尋求有效的神經(jīng)保護(hù)劑是一直以來缺血性卒中研究的重點(diǎn)，盡管動物實(shí)驗(yàn)取得了一定的效果，但目前為止尚沒有臨床證實(shí)有明確療效的神經(jīng)保護(hù)劑。近年來在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用天然植物有效成分及其制劑治療急性卒中成為研究的熱點(diǎn)，為新型神經(jīng)保護(hù)劑的研制提供了廣闊的思維空間。迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)是天然存在于多種植物中的一種多酚，也是丹參多酚酸的主要成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等多種生物活性，且在多種疾病模型中證明有效，而其在缺血卒中治療的研究鮮見報(bào)道。因此，本課題旨在研究迷迭香酸作為新型神經(jīng)保護(hù)劑的可能性及潛在的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究選用成年健康雄性CD1小鼠，建立局灶性腦缺血再灌注模型，在此模型基礎(chǔ)上觀察缺血再灌注后HO-1，Nrf2，claudin-5，MMP-9，Bcl-2和Bax的表達(dá)，應(yīng)用迷迭香酸干預(yù)，評價(jià)干預(yù)前后梗死體積、腦含水量、神經(jīng)功能缺損評分，TUNEL染色評價(jià)細(xì)胞凋亡情況，檢測迷迭香酸對HO-1，Nrf2，claudin-5，MMP-9，Bcl-2和Bax的表達(dá)調(diào)節(jié)，以期初步探討其在缺血再灌注損傷后的腦保護(hù)作用機(jī)制；應(yīng)用HO-1活性抑制劑和PI3K/Akt信號通路抑制劑進(jìn)一步探討Nrf2/HO-1通路激活在迷迭香酸發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用中的重要地位。本研究分三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。 第一部分迷迭香酸對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的抗氧化及抗凋亡機(jī)制研究 目的：觀察缺血再灌注小鼠腦缺血損傷后24h梗死體積、神經(jīng)功能缺損評分，HO-1，Nrf2，Bcl-2和Bax的表達(dá)變化，探討迷迭香酸對缺血再灌注損傷小鼠的抗氧化及抗凋亡機(jī)制。 方法：選用成年健康雄性CD-1小鼠為研究對象，采用改良Longa線栓法制備大腦中動脈缺血再灌注（MCAO/R）模型。實(shí)驗(yàn)1：觀察迷迭香酸的神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組（Sham），假手術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水；手術(shù)組（MCAO/R），再灌注后腹腔注射等量生理鹽水；迷迭香酸小劑量組（RA-L），再灌注后立即腹腔注射迷迭香酸10mg/kg；迷迭香酸中劑量組（RA-M），再灌注后立即腹腔注射迷迭香酸20mg/kg；迷迭香酸大劑量組（RA-H），再灌注后立即腹腔注射迷迭香酸40mg/kg。缺血再灌注后24h取材前Longa評分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，TTC染色評價(jià)腦梗死體積。實(shí)驗(yàn)2：觀察迷迭香酸的抗氧化及抗凋亡功能。檢測缺血腦組織中HO-1，Nrf2，Bcl-2和Bax表達(dá)的變化情況。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組，假手術(shù)組（Sham），手術(shù)組（MCAO/R），迷迭香酸中劑量組（RA-M），迷迭香酸大劑量組（RA-H）。TUNEL染色檢測缺血周圍組織的細(xì)胞凋亡情況，RT-PCR方法和Western blot方法檢測缺血腦組織HO-1，Nrf2，Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白水平的變化。 結(jié)果： 1Sham組無神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能缺損評分為0分；缺血再灌注后24h，MCAO/R組神經(jīng)功能缺損評分嚴(yán)重，RA-L組MCAO/R組相比無明顯降低神經(jīng)功能缺損，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），RA-M和RA-H組與MCAO/R組相比均可顯著降低神經(jīng)功能缺損，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； 2再灌注24h，RA-L組與MCAO/R組相比沒有明顯降低腦梗死體積，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（50.36±1.81%vs.48.09±2.45%）（P＞0.05），RA-M組（50.36±1.81%vs.41.67±0.83%）和RA-H組（50.36±1.81%vs.30.86±1.79%）與MCAO/R組相比均可明顯降低腦梗死體積，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且RA-H組較RA-M組在減少梗死體積的效果上作用更顯著（P＜0.05）。我們可以看到迷迭香酸在20mg/kg（RA-M）和40mg/kg（RA-H）時(shí)發(fā)揮更好的治療作用，因此，下面的研究集中在20mg/kg和40mg/kg。 3TUNEL染色結(jié)果，再灌注后24h，與MCAO/R組比較，RA-M組(51.75±2.36vs.41±1.41)和RA-H組(51.75±2.36vs.32.75±1.70)均可顯著減少TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，且RA-H組作用更為顯著（P＜0.05）。 4Western blot中，與MCAO/R組比較，RA-M和RA-H組在再灌注后24h均可明顯增加HO-1，Nrf2，Bcl-2的蛋白表達(dá)和明顯降低Bax蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且RA-H組作用更為顯著（P＜0.05）。 5再灌注后24h，RT-PCR分別檢測RA-M和RA-H組HO-1，Nrf2，Bcl-2和Bax的基因表達(dá)情況。與MCAO/R組相比，兩個(gè)劑量組均可明顯增加HO-1，Nrf2，Bcl-2的mRNA表達(dá)，明顯降低Bax的mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RA-H組作用更為顯著（P＜0.05）。 結(jié)論：迷迭香酸對局灶性腦缺血再灌注小鼠有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，可改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能缺失，，減小梗死體積，上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)，誘導(dǎo)Nrf2活化、HO-1表達(dá)上調(diào)，因此我們推測迷迭香酸的神經(jīng)保護(hù)作用可能通過激活Nrf2/HO-1通路，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax表達(dá)實(shí)現(xiàn)的；這些是迷迭香酸發(fā)揮其抗氧化、抗凋亡的作用，從而實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。 第二部分迷迭香酸上調(diào)HO-1表達(dá)對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠發(fā)揮多重神經(jīng)保護(hù)作用 目的：應(yīng)用HO-1活性抑制劑ZnPPIX，探討腦缺血再灌注損傷后，迷迭香酸誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)發(fā)揮抗凋亡和保護(hù)血腦屏障等多重神經(jīng)保護(hù)作用 方法：選用成年健康雄性CD1小鼠為研究對象，應(yīng)用改良Longa線栓法制備小鼠右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注（MCAO/R）模型。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組（Sham），假手術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水；手術(shù)組（MCAO/R），再灌注后腹腔注射等量生理鹽水；迷迭香酸組（RA），再灌注后立即腹腔注射迷迭香酸40mg/kg；迷迭香酸組+ZnPPIX組（RA+ZnPPIX），缺血前24h腹腔注射10mg/kg的ZnPPIX，再灌注后立即腹腔注射迷迭香酸40mg/kg；ZnPPIX組，缺血前24h腹腔注射10mg/kg的ZnPPIX。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評分，腦組織含水量測定，TTC染色評價(jià)腦梗死體積，用Western blot技術(shù)和RT-PCR技術(shù)分別檢測缺血腦組織中claudin-5, MMP-9, Bcl-2和Bax蛋白和mRNA水平的變化。 結(jié)果： 1再灌注后24h，同實(shí)驗(yàn)一結(jié)果，迷迭香酸可以降低行為學(xué)評分減小梗死體積。與MCAO/R組比較，迷迭香酸亦可減輕腦水腫，且統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異（MCAO/R組：84.09±0.60%vs. RA組：80.43±0.55%）（P＜0.05）。予以迷迭香酸藥物同時(shí)在缺血前予以10mg/kg的ZnPPIX可部分抑制上述迷迭香酸的神經(jīng)保護(hù)作用，即RA+ZnPPIX組與RA組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 2Western blot中，在缺血再灌注后24h，RA組與MCAO/R相比可明顯降低Bax、MMP-9的蛋白表達(dá)，增加claudin-5和Bcl-2的蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而ZnPPIX可部分抑制上述Bax、MMP-9、claudin-5和Bcl-2的蛋白表達(dá)的變化，即RA+ZnPPIX組與RA組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RT-PCR的結(jié)果與Western blot結(jié)果相一致。 結(jié)論：腦缺血再灌注損傷后，缺血腦組織的Bcl-2和claudin-5的表達(dá)下降，Bax和MMP-9表達(dá)增多；迷迭香酸可以減小梗死體積、減輕腦水腫，上調(diào)claudin-5的蛋白和mRNA表達(dá)，下調(diào)MMP-9的蛋白和mRNA表達(dá)，保護(hù)血腦屏障，且這一保護(hù)機(jī)制被ZnPPIX部分逆轉(zhuǎn)，結(jié)合第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示迷迭香酸干預(yù)后經(jīng)Nrf2誘導(dǎo)上調(diào)的HO-1通過調(diào)整claudin-5和MMP-9的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)血腦屏障的作用；迷迭香酸抑制缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，且這一有益的調(diào)節(jié)作用被ZnPPIX部分抑制，提示迷迭香酸上調(diào)的HO-1同時(shí)通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)發(fā)揮有效的抗凋亡保護(hù)作用。 第三部分迷迭香酸通過PI3K/Akt信號通路激活Nrf2/HO-1對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用 目的：應(yīng)用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002，探討腦缺血再灌注損傷后予以迷迭香酸激活Nrf2/HO-1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 方法：選用健康成年雄性CD1小鼠為研究對象，應(yīng)用改良Longa線栓法制備小鼠右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注模型（MCAO/R）。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組（Sham），假手術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水；手術(shù)組（MCAO/R），再灌注后腹腔注射等量生理鹽水；迷迭香酸組（RA），再灌注后立即腹腔注射迷迭香酸40mg/kg；迷迭香酸組+LY294002組（RA+LY294002），缺血前15min左側(cè)側(cè)腦室注射10mmol/L LY294002共5μL，再灌注后立即腹腔注射迷迭香酸40mg/kg；DMSO組，缺血前15min側(cè)腦室注射5μL2%DMSO。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評分，TTC染色評價(jià)腦梗死體積，用Western blot分別檢測缺血腦組織中p-Akt、Akt、Nrf2和HO-1蛋白水平的變化。 結(jié)果： 1再灌注后24h，與MCAO/R組相比較，迷迭香酸干預(yù)后p-Akt蛋白表達(dá)明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），若同時(shí)予以PI3K/Akt通路的抑制劑LY294002，表達(dá)上調(diào)的p-Akt明顯降低，即RA+LY294002與RA組比較具有顯著差異（P＜0.05），而MCAO/R與DMSO組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Akt蛋白表達(dá)各組間無顯著差異（P＞0.05）。 2MCAO/R組的HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平較Sham組上調(diào)（P＜0.05），迷迭香酸組HO-1、Nrf2蛋白明顯上調(diào)，且與MCAO/R組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。若同時(shí)予以PI3K/Akt通路的抑制劑LY294002， HO-1、Nrf2蛋白水平上調(diào)受到了抑制，即RA+LY294002與RA組比較具有顯著差異（P＜0.05）。MCAO/R與DMSO組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示側(cè)腦室注射DMSO對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響（P＞0.05）。 結(jié)論：局灶性腦缺血再灌注損傷后，予以迷迭香酸干預(yù)，p-Akt表達(dá)上升，而側(cè)腦室注射PI3K/Akt抑制劑后p-Akt表達(dá)下降，提示腦缺血再灌注后，迷迭香酸可激活PI3K/Akt信號通路；LY294002可下調(diào)Nrf2和HO-1蛋白水平，提示迷迭香酸可通過PI3K/Akt信號通路激活Nrf2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠發(fā)揮多重神經(jīng)保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【引證文獻(xiàn)】

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1 范妤;郭東艷;趙曉平;覃鴻恩;;不同純化工藝健腦益智膠囊對大鼠腦缺血-再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J];中藥材;2015年07期

本文編號：1845233