本文選題：腦缺血再灌注損傷 + Omi/HtrA2�。� 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：隨著我國人口結(jié)構(gòu)逐漸老齡化,缺血性腦卒中的發(fā)生率居高不下且明顯高于世界平均水平,特別是在東北地區(qū),由于氣候和飲食習(xí)慣等因素,缺血性腦血管病的發(fā)生更為常見,給患者帶了不可估量的傷害,同時給社會及家庭帶來的沉重的負(fù)擔(dān)。缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中后的一個極為重要的病理生理過程,近年來的研究表明,缺血再灌注損傷的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程,與眾多因素相關(guān),因此研究缺血再灌注損傷的機(jī)制,可能是治療缺血性腦血管病的基礎(chǔ)。線粒體作為一個能量中心,是細(xì)胞制造能量及有氧呼吸的主要場所,除此以外,線粒體還參與諸如1、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程,并擁有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力,因此保持線粒體的穩(wěn)態(tài)對細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸及機(jī)體的功能尤為重要。線粒體的結(jié)構(gòu)和功能損傷在腦缺血再灌注早期出現(xiàn),是腦缺血后級聯(lián)反應(yīng)的"啟動點";是腦缺血直接損傷和遲發(fā)性神經(jīng)元壞死的主要原因之一,也是啟動細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。多年的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生時,線粒體穩(wěn)態(tài)被破壞,導(dǎo)致細(xì)胞色素C被釋放,進(jìn)而引起凋亡的發(fā)生。Omi/HtrA2是一個種寡聚絲氨酸蛋白酶,位于線粒體膜間隙中,正常情況下它在線粒體內(nèi)外的流動保持著動態(tài)平衡,當(dāng)這種平衡被打破時可通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本文即采用激光掃描共聚焦、蛋白電泳、PCR-Array等技術(shù),研究大鼠腦缺血再灌注后線粒體的損傷途徑。丁苯酞作為我國自主研發(fā)的藥物,其主要成分是消旋-3-正丁基苯酞,通過多年的臨床應(yīng)用及實驗研究證明了其可以通過多種途徑對神經(jīng)細(xì)胞達(dá)到保護(hù)作用,且具有較好的安全性。本研究運用改良經(jīng)典線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,運用 Omi/HtrA2 特異性抑制劑UCF101與丁苯酞對比研究,通過觀察Omi/HtrA2在線粒體內(nèi)外的表達(dá);X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP),caspase-3、-9,線粒體塑形蛋白Optic Atrophy 1(OPA1),Caseinolyticprotease(ClpP)等的變化;運用蛋白芯片技術(shù)檢測線粒體及線粒體能量代謝信號通路相關(guān)基因的表達(dá),從而探討丁苯酞對線粒體的保護(hù)作用,為其更好的應(yīng)用于臨床提供理論基礎(chǔ)。第一部分腦缺血再灌注后線粒體的損傷和UCF-101對線粒體的保護(hù)作用及機(jī)制目的:探討腦缺血再灌注后線粒體的損傷和UCF-101對線粒體的保護(hù)作用及機(jī)制方法:選擇健康成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組、MCAO組、MCAO+UCF-101組,每組10只。通過改良經(jīng)典建立大鼠局灶性腦缺血模型,缺血1.5h,于缺血后75min給予UCF-101(10umol/kg)或同等量生理鹽水腹腔注射,待大鼠完全清醒后,評價大鼠行為學(xué)。再灌注24小時,處死取腦。TUNEL染色檢測神經(jīng)元的凋亡情況;激光掃描共聚焦法檢測Omi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL 蛋白的變化;Western blot 法檢測 Omi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL、CHOP、ClpP 等蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:與MCAO組(32.81±3.44)相比,MCAO+UCF-101 組(18.62±2.28)神經(jīng)元的凋亡指數(shù)明顯減少p0.01;激光共聚焦結(jié)果顯示,MCA0組vs MCAO+UCF-101組 0mi/HtrA2和PARL的表達(dá)被抑制;Westernbolt 檢測0mi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL、OPA1、XIAP、CHOP、ClpP蛋白的表達(dá)被抑制。第二部分NBP對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制目的:探討NBP對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法:選擇健康成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、模型(MCAO)組、小劑量NBP(20mg/kg)、大劑量NBP(80mg/kg)組,每組7只。通過改良經(jīng)典建立大鼠局灶性腦缺血模型,缺血1.5h,于缺血后1h給予NBP(20 mg/kg和80mg/kg)或同等量生理鹽水腹腔注射。待大鼠完全清醒后,評價大鼠行為學(xué)。再灌注24小時后,處死取腦HE染色觀察神經(jīng)元損傷情況;TTC染色觀察梗死體積變化;TUNEL染色檢測凋亡情況;從而綜合評價NBP對大鼠局灶行腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。結(jié)果:與 MCAO 組(6.27±0.78)相比,無論是 20mgNBP 組(10.14±1.36)還是80mgNBP組(13.28±1.42),大鼠的神經(jīng)功能都一定的改善P0.01,且80mg組大鼠神經(jīng)功能的改善優(yōu)于20mg組P0.05;BIVP,20mg NBP(22.28±2.47)、80mg NBP(16.42±2.76)VS MCAO組(28.42±1.91)體積明顯縮小P0.01,神經(jīng)細(xì)胞無論從形態(tài)學(xué)還是凋亡方面都明顯好于模型組。且呈劑量依賴型趨勢,80 mg/kg組作用更為明顯。第三部分NBP對線粒體的保護(hù)作用及可能機(jī)制目的:探討NBP對線粒體的保護(hù)作用及可能機(jī)制方法:選擇健康成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型(MCAO)組、小劑量NBP(20mg/kg)、大劑量NBP(80 mg/kg)組,每組7只。通過改良經(jīng)典建立大鼠局灶性腦缺血模型,缺血1.5h,于缺血后1h給予NBP(20 mg/kg和80 mg/kg)或同等量生理鹽水腹腔注射。再灌注24小時后處死取腦,激光掃描共聚焦法及 Western blot 法檢測 Omi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL 蛋白的表達(dá)情況;運用PCR Array法檢測NBP對線粒體及能量代謝相關(guān)基因mRNA的影響。結(jié)果:與 MCAO 組相比,NBP 組大鼠 Omi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL等蛋白的表達(dá)抑制明顯;PCR Array結(jié)果顯示,相比與Sham組,MCAO組的線粒體及其能量代謝均降低,而應(yīng)用NBP后無論是線粒體還是線粒體能量代謝均得到了大幅改善。結(jié)論:1.腦缺血再灌注發(fā)生后對線粒體有多種損傷作用,而應(yīng)用0mi/HtrA2特異性抑制劑UCF-101可以通過多種途徑,減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。2.早期應(yīng)用NBP能夠明顯改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后的神經(jīng)行為學(xué)評分,減小梗死體積,抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,減輕腦缺血再灌注損傷。3.NBP能夠通過抑制Omi/HtrA2的表達(dá)從而減輕凋亡;同時NBP能夠明顯保護(hù)、改善腦缺血再灌注損傷后線粒體及能量代謝。
[Abstract]:Ischemia / reperfusion injury is an important pathological process in the treatment of ischemic cerebrovascular diseases . In this study , we studied the protective effects of Omi / HtrA2 on the mitochondria and the mechanism of apoptosis by using Omi / HtrA2 specific inhibitor UCF101 and butylphthalide . The protective effect and mechanism of NBP on focal cerebral ischemia - reperfusion injury in rats were studied . The protective effects of NBP on mitochondria and energy metabolism were studied by means of PCR Array . Results : Compared with the sham group , the effects of NBP on mitochondria and energy metabolism were significantly improved . At the same time , NBP can obviously protect and improve the mitochondria and energy metabolism after cerebral ischemia reperfusion injury .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3

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