本文選題：損傷修復(fù) + PTEN沉默　； 參考：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展,基因工具成為研究基因和蛋白之間相互關(guān)系、探索細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路、解密受損細(xì)胞修復(fù)機(jī)制、開(kāi)發(fā)神經(jīng)保護(hù)類(lèi)藥物的有力手段。前期研究表明用化學(xué)合成的si RNA體外轉(zhuǎn)染類(lèi)神經(jīng)元細(xì)胞沉默PTEN基因能夠激活m TOR信號(hào)通路,促進(jìn)類(lèi)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng),以及氧化應(yīng)激的類(lèi)神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)。但是用si RNA研究基因和蛋白之間的相互關(guān)系存在一定局限性,例如無(wú)法更換啟動(dòng)子、無(wú)法實(shí)現(xiàn)基因的長(zhǎng)效抑制,為了更進(jìn)一步的研究PTEN基因與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷之間的相互關(guān)系,我們將目光聚焦于micro RNA介導(dǎo)的基因沉默。選擇含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(e GFP)標(biāo)記物的慢病毒載體p WPXL(12257)為載體骨架,選擇靶向PTEN m RNA的micro RNA作為目的基因,構(gòu)建重組慢病毒載體,實(shí)現(xiàn)對(duì)PTEN m RNA的特異性沉默;隨后運(yùn)用慢病毒包裝技術(shù)將重組慢病毒載體包裝成慢病毒顆粒,用慢病毒顆粒感染細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮基因沉默效能,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞PTEN基因高效、穩(wěn)定、長(zhǎng)期干擾。通過(guò)在大鼠脊髓半橫斷損傷模型注射慢病毒顆粒觀察和檢測(cè)慢病毒顆粒能否在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá),且發(fā)揮基因干擾效能。方法:通過(guò)引物設(shè)計(jì)(轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為靶向PTEN m RNA的micro RNA)、PCR、膠回收、T載體連接、酶切、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、目的片段與載體骨架連接的方法進(jìn)行三個(gè)重組慢病毒載體構(gòu)建,命名為12257-PTEN-micro RNA1、12257-PTENmicro RNA2、和12257-PTEN-micro RNA3;重組慢病毒載體進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)目的片段是否與載體骨架相連、序列是否正確;用重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞觀察重組載體能否激活m TOR信號(hào)通路,比較三個(gè)重組慢病毒載體的基因沉默效能;將干擾效率最高的重組慢病毒載體包裝成慢病毒顆粒,該實(shí)驗(yàn)分為三組:(1)空白對(duì)照組;(2)空載體感染組;(3)PTEN RNAi組。檢測(cè)慢病毒顆粒滴度,RT-PCR方法驗(yàn)證慢病毒顆粒的基因沉默效能。通過(guò)脊髓注射的方法用慢病毒顆粒感染大鼠脊髓半橫斷損傷模型,該實(shí)驗(yàn)分為四組,每組6只:(1)假手術(shù)組;(2)單純損傷組;(3)空載體病毒顆粒感染組;(4)PTEN RNAi組;造模成功后第十四天取出腦組織;制作石蠟切片、進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、觀察病毒顆粒在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的基因沉默效能。結(jié)果:三個(gè)重組慢病毒載體測(cè)序結(jié)果與原有序列比對(duì)顯示干擾序列與載體骨架連接成功,序列正確;重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞結(jié)果顯示p S6K陽(yáng)性表達(dá),其中重組慢病毒載體12257-PTEN-micro RNA2(在后續(xù)試驗(yàn)中寫(xiě)作12257-PTEN-micro RNA)p S6K表達(dá)水平最高;將基因干擾效率最高的重組慢病毒載體12257-PTEN-micro RNA包裝成慢病毒顆粒,滴度測(cè)定結(jié)果顯示空載體感染組BT=4×108TU/ml,PTEN RNAi組BT=7×108TU/ml;重組慢病毒顆粒感染C6細(xì)胞72小時(shí)后RT-PCR結(jié)果表明,與空載體感染組相比,PTEN RNAi組PTEN m RNA表達(dá)水平明顯降低(P0.05);慢病毒顆粒感染大鼠脊髓半橫斷損傷模型14天后,腦組織運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組、單純損傷組e GFP陰性表達(dá),空載體病毒顆粒感染組、PTEN干擾組e GFP陽(yáng)性表達(dá);假手術(shù)組、單純損傷組、空載體病毒顆粒感染組p S6K陰性表達(dá),PTEN干擾組p S6K陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論:成功構(gòu)建能夠沉默PTEN基因的重組慢病毒載體,重組慢病毒載體包裝成的慢病毒顆粒能夠穩(wěn)定感染體內(nèi)外細(xì)胞,病毒顆粒能夠沿軸突逆行至神經(jīng)元胞體,通過(guò)長(zhǎng)期穩(wěn)定的沉默PTEN基因,發(fā)揮基因干擾作用。
[Abstract]:In order to further study the relationship between PTEN gene and central nervous system injury , it was suggested that the expression of PTEN gene could be activated by slow virus particles . The results showed that the recombinant lentivirus vector 12257 - PTEN - micro RNA2 ( 12257 - PTEN - micro RNA in the follow - up trial ) had the highest expression level . Conclusion : A recombinant lentivirus vector capable of silencing PTEN gene is successfully constructed . The recombinant lentivirus particles can stably infect the external cells in vivo , and the virus particles can retrograde to the neuronal cell body along the axon , and play a role in gene interference through the long - term stable silencing of PTEN gene .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R741

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Sedat Dalbayrak;Onur Yaman;Tevfik Y?lmaz;;Current and future surgery strategies for spinal cord injuries[J];World Journal of Orthopedics;2015年01期

2 俞媛;陳曉蓉;;PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用[J];臨床肝膽病雜志;2014年09期

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本文編號(hào)：1808061