本文選題：損傷修復(fù) + PTEN沉默�。� 參考：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展,基因工具成為研究基因和蛋白之間相互關(guān)系、探索細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路、解密受損細胞修復(fù)機制、開發(fā)神經(jīng)保護類藥物的有力手段。前期研究表明用化學(xué)合成的si RNA體外轉(zhuǎn)染類神經(jīng)元細胞沉默PTEN基因能夠激活m TOR信號通路,促進類神經(jīng)元突起的生長,以及氧化應(yīng)激的類神經(jīng)元生長錐的生長。但是用si RNA研究基因和蛋白之間的相互關(guān)系存在一定局限性,例如無法更換啟動子、無法實現(xiàn)基因的長效抑制,為了更進一步的研究PTEN基因與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷之間的相互關(guān)系,我們將目光聚焦于micro RNA介導(dǎo)的基因沉默。選擇含有增強型綠色熒光蛋白(e GFP)標(biāo)記物的慢病毒載體p WPXL(12257)為載體骨架,選擇靶向PTEN m RNA的micro RNA作為目的基因,構(gòu)建重組慢病毒載體,實現(xiàn)對PTEN m RNA的特異性沉默;隨后運用慢病毒包裝技術(shù)將重組慢病毒載體包裝成慢病毒顆粒,用慢病毒顆粒感染細胞進而發(fā)揮基因沉默效能,實現(xiàn)對靶細胞PTEN基因高效、穩(wěn)定、長期干擾。通過在大鼠脊髓半橫斷損傷模型注射慢病毒顆粒觀察和檢測慢病毒顆粒能否在實驗動物體內(nèi)長期穩(wěn)定表達,且發(fā)揮基因干擾效能。方法:通過引物設(shè)計(轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為靶向PTEN m RNA的micro RNA)、PCR、膠回收、T載體連接、酶切、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、目的片段與載體骨架連接的方法進行三個重組慢病毒載體構(gòu)建,命名為12257-PTEN-micro RNA1、12257-PTENmicro RNA2、和12257-PTEN-micro RNA3;重組慢病毒載體進行測序檢測目的片段是否與載體骨架相連、序列是否正確;用重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染PC12細胞觀察重組載體能否激活m TOR信號通路,比較三個重組慢病毒載體的基因沉默效能;將干擾效率最高的重組慢病毒載體包裝成慢病毒顆粒,該實驗分為三組:(1)空白對照組;(2)空載體感染組;(3)PTEN RNAi組。檢測慢病毒顆粒滴度,RT-PCR方法驗證慢病毒顆粒的基因沉默效能。通過脊髓注射的方法用慢病毒顆粒感染大鼠脊髓半橫斷損傷模型,該實驗分為四組,每組6只:(1)假手術(shù)組;(2)單純損傷組;(3)空載體病毒顆粒感染組;(4)PTEN RNAi組;造模成功后第十四天取出腦組織;制作石蠟切片、進行免疫組織化學(xué)染色、觀察病毒顆粒在實驗動物體內(nèi)的基因沉默效能。結(jié)果:三個重組慢病毒載體測序結(jié)果與原有序列比對顯示干擾序列與載體骨架連接成功,序列正確;重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染PC12細胞結(jié)果顯示p S6K陽性表達,其中重組慢病毒載體12257-PTEN-micro RNA2(在后續(xù)試驗中寫作12257-PTEN-micro RNA)p S6K表達水平最高;將基因干擾效率最高的重組慢病毒載體12257-PTEN-micro RNA包裝成慢病毒顆粒,滴度測定結(jié)果顯示空載體感染組BT=4×108TU/ml,PTEN RNAi組BT=7×108TU/ml;重組慢病毒顆粒感染C6細胞72小時后RT-PCR結(jié)果表明,與空載體感染組相比,PTEN RNAi組PTEN m RNA表達水平明顯降低(P0.05);慢病毒顆粒感染大鼠脊髓半橫斷損傷模型14天后,腦組織運動皮質(zhì)區(qū)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組、單純損傷組e GFP陰性表達,空載體病毒顆粒感染組、PTEN干擾組e GFP陽性表達;假手術(shù)組、單純損傷組、空載體病毒顆粒感染組p S6K陰性表達,PTEN干擾組p S6K陽性表達。結(jié)論:成功構(gòu)建能夠沉默PTEN基因的重組慢病毒載體,重組慢病毒載體包裝成的慢病毒顆粒能夠穩(wěn)定感染體內(nèi)外細胞,病毒顆粒能夠沿軸突逆行至神經(jīng)元胞體,通過長期穩(wěn)定的沉默PTEN基因,發(fā)揮基因干擾作用。
[Abstract]:In order to further study the relationship between PTEN gene and central nervous system injury , it was suggested that the expression of PTEN gene could be activated by slow virus particles . The results showed that the recombinant lentivirus vector 12257 - PTEN - micro RNA2 ( 12257 - PTEN - micro RNA in the follow - up trial ) had the highest expression level . Conclusion : A recombinant lentivirus vector capable of silencing PTEN gene is successfully constructed . The recombinant lentivirus particles can stably infect the external cells in vivo , and the virus particles can retrograde to the neuronal cell body along the axon , and play a role in gene interference through the long - term stable silencing of PTEN gene .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R741

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Sedat Dalbayrak;Onur Yaman;Tevfik Y?lmaz;;Current and future surgery strategies for spinal cord injuries[J];World Journal of Orthopedics;2015年01期

2 俞媛;陳曉蓉;;PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用[J];臨床肝膽病雜志;2014年09期

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本文編號：1808061