本文選題：缺血性腦卒中 + 神經(jīng)再生�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：缺血性腦卒中是由于流向大腦區(qū)域的血流中斷,導(dǎo)致氧氣和葡萄糖供應(yīng)缺乏而引起的,是全球死亡和成人致殘的主要原因。更重要的是,隨著人口老齡化的到來(lái),人們預(yù)期壽命的增加,中風(fēng)的發(fā)病率和患病率預(yù)計(jì)將進(jìn)一步上升,已成為世界上最重要的健康問(wèn)題之一。盡管靜脈內(nèi)溶栓目前批準(zhǔn)用于治療急性缺血性中風(fēng),但由于其狹窄的治療時(shí)間窗和安全問(wèn)題,其臨床應(yīng)用仍然受到限制。因此,大多數(shù)中風(fēng)患者將有殘留的神經(jīng)功能缺陷。所以,這就強(qiáng)調(diào)需要開發(fā)神經(jīng)恢復(fù)劑,從而減少腦損傷程度或恢復(fù)卒中后腦功能。盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)能力有限,但是腦缺血后會(huì)有一定程度的自發(fā)性修復(fù),這種修復(fù)過(guò)程涉及血管新生、神經(jīng)再生、軸突出芽和突觸發(fā)生。自從報(bào)道稱大腦有能力在一個(gè)稱為神經(jīng)再生微環(huán)境的區(qū)域形成新的神經(jīng)元,神經(jīng)再生就開始成為一個(gè)廣受關(guān)注的話題。包括人在內(nèi)的各種哺乳動(dòng)物中,成年腦中側(cè)腦室的室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下區(qū)(subgranular zone,SGZ)是神經(jīng)再生的兩個(gè)主要部位,含有神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs),具有增殖、遷移并分化為成熟神經(jīng)元的能力。缺血性卒中后,血管新生是形成新的腦微血管的重要過(guò)程,可改善缺血半暗帶區(qū)的組織微灌注,并且血管新生被證實(shí)影響腦缺血后神經(jīng)再生和成神經(jīng)細(xì)胞遷移的過(guò)程。同時(shí),腦缺血誘導(dǎo)SVZ區(qū)神經(jīng)再生,新生成的神經(jīng)元向有新生血管的皮層缺血半暗帶遷移,并且在神經(jīng)遷移過(guò)程中,成神經(jīng)細(xì)胞與腦血管密切相關(guān)。最近的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明,中風(fēng)后神經(jīng)功能改善可能是通過(guò)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元替代誘導(dǎo)的。因此,旨在激活腦缺血后自我修復(fù)系統(tǒng)以替代死亡的神經(jīng)元,這將是一個(gè)很有前景的研究領(lǐng)域。經(jīng)典Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用,并繼續(xù)調(diào)節(jié)整個(gè)成年時(shí)期的多種過(guò)程,包括干細(xì)胞池的維持和自我更新、祖細(xì)胞增殖和成年神經(jīng)發(fā)生。最近許多關(guān)注集中在Wnt/β-Catenin信號(hào)對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵作用,而越來(lái)越多的研究也證實(shí)其在SVZ區(qū)神經(jīng)祖細(xì)胞增殖以及神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中起重要作用。大量證據(jù)證明Wnt/β-Catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)中風(fēng)后SVZ區(qū)神經(jīng)發(fā)生過(guò)程,從而參與中風(fēng)后的神經(jīng)修復(fù)。因此,靶向激活Wnt/β-Catenin信號(hào)傳導(dǎo)活性從而促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生可能是促進(jìn)組織修復(fù)和功能恢復(fù)的再生治療策略的一種新方法。L-3-正丁基苯酞最早提取于芹菜種子中,dl-3-正丁基苯酞(dl-3-nbutylphthalide,dl-NBP)是基于此化學(xué)合成的含有L-和D-異構(gòu)體的手性化合物,并于2005年被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(SFDA)批準(zhǔn)作為臨床治療缺血性卒中的新型藥物。臨床試驗(yàn)表明:NBP可以顯著改善缺血性腦卒中患者的行為結(jié)果和認(rèn)知功能,具有良好的安全性和耐受性。許多基礎(chǔ)研究也已證實(shí),NBP可通過(guò)多重藥理機(jī)制用于治療缺血性中風(fēng),是一種有益和有前景的藥物,包括抑制血小板聚集和抗血栓形成,保護(hù)線粒體功能,調(diào)節(jié)能量代謝,減少神經(jīng)元凋亡,減少氧化損傷,下調(diào)自噬活性,抑制炎癥和保護(hù)血腦屏障。此外,NBP可以促進(jìn)嚙齒動(dòng)物卒中后的血管新生和改善腦微循環(huán)。然而,以前的研究中關(guān)于NBP對(duì)缺血性中風(fēng)后神經(jīng)再生的研究卻很少。本研究采用健康成年雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象,建立電凝法遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈閉塞(distal middle cerebral artery occlusion,d MCAO)模型。在本研究中,我們主要研究dl-NBP是否改善腦缺血后神經(jīng)恢復(fù)和促進(jìn)SVZ區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)再生,以及Wnt/β-Catenin通路和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用是否參與其中。本研究分為三部分,各部分內(nèi)容概述如下。第一部分丁苯酞對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠神經(jīng)功能改善、腦保護(hù)及促進(jìn)血管新生的作用目的:通過(guò)對(duì)dl-NBP干預(yù)后實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的神經(jīng)功能缺損、腦梗死體積、腦萎縮體積、腦血流改變以及血管密度的測(cè)定,研究dl-NBP對(duì)腦缺血小鼠的神經(jīng)保護(hù)及血管新生作用。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象,通過(guò)電凝法建立d MCAO模型。實(shí)驗(yàn)一:將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為以下各組:假手術(shù)組(Sham):動(dòng)物接受假手術(shù)和等體積的0.5%吐溫-80;Vehicle組(Vehicle):動(dòng)物接受d MCAO和等體積的0.5%吐溫-80;NBP低劑量組(NBP-L):動(dòng)物接受d MCAO,并給予10 mg/kg NBP;NBP中劑量組(NBP-M):動(dòng)物接受d MCAO,并給予20 mg/kg NBP;NBP高劑量組(NBP-H):動(dòng)物接受d MCAO,并給予40 mg/kg NBP。術(shù)后1天開始給予NBP腹腔注射直至取材或連續(xù)13天,分別于術(shù)前、術(shù)后3、7、14、21、28天對(duì)各組小鼠進(jìn)行Rota-Rod、m NSS神經(jīng)功能評(píng)分,同時(shí)測(cè)量體重變化。實(shí)驗(yàn)二:將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為以下各組:Vehicle組(Vehicle)和NBP中劑量組(NBP),于術(shù)后7天用TTC染色法測(cè)定腦梗死體積,28天用HE染色測(cè)定腦萎縮體積,于術(shù)前、術(shù)后即刻、7、14、28天使用激光散斑成像儀監(jiān)測(cè)腦血流量(CBF)。實(shí)驗(yàn)三:將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為以下各組:假手術(shù)組(Sham)、Sham+NBP組(Sham+NBP)、Vehicle組(Vehicle)和NBP中劑量組(NBP),于術(shù)后14天用CD-31染色分析缺血半暗帶的微血管密度。結(jié)果:1 Rota-Rod實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在第7天,與Vehicle組相比,三種劑量的NBP均明顯改善了神經(jīng)功能恢復(fù)(P0.01)。然而,隨后在第14、21和28天僅NBP-M組顯示出明顯差異(P0.01)。m NSS結(jié)果顯示:在術(shù)后第3、7天,Vehicle組和NBP組之間沒(méi)有顯著差異。但是中風(fēng)后14、21、28天,NBP-M組小鼠的神經(jīng)缺陷評(píng)分明顯低于Vehicle組(*P0.05,**P0.01)。但是,NBP-L和NBP-H組在任何時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有顯示出明顯差異。體重變化結(jié)果顯示:接受手術(shù)后不同組中的小鼠的體重在前3天快速降低,然后在第14或21天緩慢恢復(fù)至基線水平。然而,五組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。鑒于NBP-M組明顯改善神經(jīng)功能缺損癥狀,我們選擇20 mg/kg NBP進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2 TTC染色結(jié)果顯示:在d MCAO后第7天,NBP組小鼠的腦梗塞體積顯著小于Vehicle組(P0.05)。HE染色結(jié)果顯示:在d MCAO后第28天,Vehicle組和NBP組腦萎縮體積無(wú)明顯差異(P0.05)。3 CBF測(cè)量結(jié)果顯示:小鼠d MCAO后對(duì)側(cè)的腦灌注量輕微降低(約下降到83%),但在同側(cè)CBF立即明顯降低至約38%基線水平(P0.001)。右側(cè)MCA供血區(qū)域中,CBF隨著時(shí)間的推移逐漸恢復(fù),在第14天達(dá)最大恢復(fù)水平。并且,在第14天,與Vehicle組小鼠相比,NBP小鼠顯示出更高的CBF(P0.05)。在中風(fēng)后即刻、7天和28天,Vehicle組和NBP組小鼠腦灌注量未觀察到明顯差異。CD31免疫熒光染色顯示:在d MCAO后第14天,與Vehicle組相比,NBP組小鼠缺血半暗帶區(qū)的微血管密度顯著增多(P0.01)。第二部分丁苯酞對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制研究目的:通過(guò)測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物及Wnt/β-Catenin通路相關(guān)因子表達(dá)水平,觀察dl-NBP對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖以及Wnt/β-Catenin的影響。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象,通過(guò)電凝法建立d MCAO模型。實(shí)驗(yàn)一:將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為以下各組:假手術(shù)組(Sham),Sham+NBP組(Sham+NBP),Vehicle組(Vehicle)和NBP組(NBP)。于術(shù)后7天、14天使用Brd U+和Brd U+/Nestin+標(biāo)記評(píng)估NBP對(duì)神經(jīng)增殖的影響,于術(shù)后7天通過(guò)qRT-PCR和Western Blot測(cè)量Wnt通路在NBP治療中的作用。實(shí)驗(yàn)二:將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為以下各組:Vehicle組(Vehicle)、NBP組(NBP)、DKK1組(DKK1)和DKK1+NBP組(DKK1+NBP)。重組人類DKK1蛋白(rh DKK1)用于阻止經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。將DKK1以0.1μg/μl的濃度溶于無(wú)菌PBS中,并在術(shù)后第1天和第4天將1μl溶液通過(guò)腦室注射到同側(cè)側(cè)腦室。于術(shù)后7天使用Brd U+和Brd U+/Nestin+標(biāo)記評(píng)估NBP對(duì)神經(jīng)增殖的影響,于術(shù)后7天通過(guò)qRT-PCR和Western Blot測(cè)量Wnt通路在NBP治療中的作用。結(jié)果:1與Sham組小鼠相比,腦缺血后7天和14天,同側(cè)SVZ中Brd U和Brd U/Nestin-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加。與Vehicle組相比,20 mg/kg NBP明顯增加了同側(cè)SVZ中的Brd U和Brd U/Nestin-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P0.01)。2 qRT-PCR分析顯示:與Vehicle組相比,NBP組明顯增加Wnt通路相關(guān)基因如Wnt-3a、β-Catenin、核轉(zhuǎn)錄因子(TCF-4)和Wnt靶基因(Cyclin D1)的表達(dá),抑制GSK-3β的基因表達(dá)(*P0.05,**P0.01)。Western blot分析顯示,與Vehicle組相比,NBP組明顯增加Wnt-3a、TCF-4、Cyclin D1的蛋白表達(dá)及p-GSK-3β/GSK-3β的比例,降低p-β-Catenin/β-Catenin的比例(P0.05)。3 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示:在d MCAO小鼠腦組織,側(cè)腦室注射DKK1引起Wnt下游信號(hào)分子β-Catenin明顯減少(*P0.05,**P0.01)。在術(shù)后7天,DKK1抑制Wnt信號(hào)通路后可導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞增殖減少(P0.05)。然而,與DKK1組相比,DKK1+NBP組顯著增加了Brd U和Brd U/Nestin-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(P0.01)。4 qRT-PCR分析顯示:腦室內(nèi)注射DKK1引起GSK-3β表達(dá)增強(qiáng),β-Catenin、TCF-4和Cyclin D1表達(dá)降低,而DKK1+NBP治療逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果(▲P0.05,▲▲P0.01)。Western blot分析顯示:DKK1處理顯著降低p-GSK-3β/GSK-3β的比例,減少轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因如TCF-4和Cyclin D1表達(dá)水平,并增加p-β-Catenin/β-Catenin的比例,然而DKK1+NBP治療后逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果(▲P0.05,▲▲P0.01)。這些結(jié)果表明NBP通過(guò)激活Wnt/β-Catenin通路,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。第三部分丁苯酞對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠神經(jīng)干細(xì)胞遷移和分化的影響及其相關(guān)機(jī)制研究目的:通過(guò)測(cè)定神經(jīng)干細(xì)胞遷移和成熟的標(biāo)記物及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)因子表達(dá)水平,觀察dl-NBP對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠神經(jīng)干細(xì)胞遷移、分化以及對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象,通過(guò)電凝法建立d MCAO模型。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為以下各組:假手術(shù)組(Sham)、Sham+NBP組(Sham+NBP)、Vehicle組(Vehicle)和NBP組(NBP)。于術(shù)后14天使用DCX+和Brd U+/DCX+標(biāo)記評(píng)估NBP對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響,通過(guò)qRT-PCR、Western Blot和免疫熒光染色測(cè)量NBP對(duì)VEGF、BDNF、SDF-1等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響。于術(shù)后28天使用Brd U+/Neu N+、Brd U+/GFAP+來(lái)評(píng)估NBP對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。結(jié)果:1 Sham組中DCX+主要位于SVZ區(qū),而腦缺血后,大量的DCX+細(xì)胞分布在同側(cè)SVZ和缺血性皮層之間的白質(zhì)中。20 mg/kg NBP促進(jìn)更多的DCX+細(xì)胞從SVZ沿著胼胝體向缺血皮層的路徑遷移(P0.01)。沿著胼胝體三個(gè)區(qū)域的每個(gè)區(qū)域單獨(dú)分析時(shí),NBP組DCX+細(xì)胞密度均高于Vehicle組(P0.05)。同時(shí),與Sham組相比,Vehicle組明顯增加了Brd U+/DCX+細(xì)胞數(shù)量。與Vehicle組相比,NBP組中Brd U+/DCX+細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.01)。并且,DCX-陽(yáng)性細(xì)胞遷移過(guò)程中位于胼胝體CD31標(biāo)記的血管附近。2 qRT-PCR分析顯示,在術(shù)后14天,NBP處理的小鼠中VEGF和BDNF的基因表達(dá)顯著高于Vehicle組小鼠(P0.05)。在Vehicle和NBP組之間,SDF-1基因水平?jīng)]有顯著差異。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):在術(shù)后第14天,Sham組VEGF和BDNF的蛋白表達(dá)較低,但NBP組蛋白表達(dá)明顯高于Vehicle組(P0.05)。Vehicle和NBP組之間SDF-1表達(dá)沒(méi)有顯著差異。免疫熒光染色顯示:在缺血半暗帶區(qū)域,NBP組VEGF和BDNF陽(yáng)性皮層神經(jīng)元明顯多于Vehicle組(P0.05)。免疫熒光雙標(biāo)記顯示:VEGF和BDNF分別共定位于缺血皮質(zhì)中的CD31陽(yáng)性細(xì)胞,表明這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子部分來(lái)源于皮層腦微血管。3在術(shù)后第28天,Sham組小鼠皮層沒(méi)有檢測(cè)到Brd U/Neu N-陽(yáng)性細(xì)胞。與Vehicle組相比,NBP組小鼠皮層中Brd U/Neu N-陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯增加(P0.001)。然而,在Vehicle組和NBP組之間,Brd U/GFAP-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P0.05)。與Sham組相比,Vehicle組缺血半暗帶皮層中GFAP+細(xì)胞密度顯著增加(P0.001)。然而,Vehicle組和NBP組之間沒(méi)有明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1本實(shí)驗(yàn)在成年雄性C57BL/6小鼠成功建立電凝法d MCAO模型,發(fā)現(xiàn)術(shù)后1天腹腔注射NBP 20 mg/kg可以顯著降低小鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀,且在術(shù)后7天明顯減小腦梗死體積,提示20 mg/kg NBP有腦保護(hù)作用,在慢性期可顯著促進(jìn)腦缺血小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。2 NBP干預(yù)可以使小鼠缺血半暗帶區(qū)的微血管密度顯著增多,改善腦血流灌注量,提示NBP有促進(jìn)血管新生的作用。3 NBP干預(yù)可以通過(guò)激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路促進(jìn)缺血性卒中后SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖,通過(guò)上調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)募集更多的內(nèi)源性成神經(jīng)細(xì)胞遷移到受損區(qū)域,并分化為成熟的神經(jīng)元,從而改善慢性期腦缺血小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1805518