本文選題：TAM + 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞��； 參考：《蘇州大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的探討蛋白激酶C（PKC）抑制劑他莫昔芬（tamoxifen，TAM）聯(lián)合X射線對人腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、凋亡和放射敏感性的影響及其機(jī)制，構(gòu)建人腦膠質(zhì)瘤裸鼠原位瘤，在體內(nèi)驗(yàn)證TAM的放射增敏作用。 方法（一）體外實(shí)驗(yàn)1、MTT法檢測不同TAM濃度、不同處理時(shí)間腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的增殖變化；2、劃痕實(shí)驗(yàn)觀察腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的遷移能力；3、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測TAM對腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的放射敏感性的影響；4、流式細(xì)胞儀測定TAM聯(lián)合X射線對腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的周期分布和細(xì)胞凋亡的影響；5、western-blot法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平的變化。 （二）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位模型，將成瘤的裸鼠隨機(jī)分為對照組、放療組、TAM組、放療+TAM組，每組5只。MRI評估原位瘤裸鼠腫瘤體積大小，處死裸鼠取瘤組織，免疫組化檢測瘤組織中與凋亡相關(guān)的蛋白Bad的變化。 結(jié)果（一）體外實(shí)驗(yàn)：1、TAM可顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的增殖，當(dāng)TAM濃度為10μmol/L時(shí)，A172細(xì)胞的存活率為95.1%，U251細(xì)胞的存活率為93.9%，且與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究選擇10μmol/L藥物濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。2、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示TAM聯(lián)合X射線可顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的遷移能力。3、TAM聯(lián)合X射線照射作用腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞克隆存活率隨照射劑量的增加而減少（p＜0.01），，多靶單擊模型擬合劑量存活曲線，A172細(xì)胞單純照射組的平均致死劑量（D0）和準(zhǔn)閾劑量（Dq）分別2.46Gy和2.97Gy，照射+TAM組的D0和Dq分別為1.97Gy和2.80Gy，A172細(xì)胞的放射增敏比（SER）為1.25；U251細(xì)胞單純照射組的D0和Dq分別為2.60Gy和0.91Gy，照射+TAM組的D0和Dq分別為1.78Gy和1.34Gy，U251細(xì)胞的放射增敏比（SER）為1.46。4、TAM聯(lián)合X射線使人腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯且不可逆轉(zhuǎn)。5、TAM聯(lián)合X射線可顯著增加人腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞的凋亡率（p＜0.01）。6、western-blot結(jié)果顯示，TAM聯(lián)合X射線作用腦膠質(zhì)瘤A172、U251細(xì)胞能顯著抑制PKCι和Cdk7的活性，周期蛋白cyclinB1的表達(dá)減少，而凋亡蛋白Bad的表達(dá)明顯增加，caspase3的活性增加，PARP的活性降低。（二）體內(nèi)試驗(yàn)：1、構(gòu)建原位腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞的荷瘤鼠模型，MRI檢查結(jié)果顯示照射+TAM組腫瘤體積比其他實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積明顯小，免疫組化顯示照射+TAM組腫瘤組織Bad表達(dá)增高。 結(jié)論（1）TAM能明顯抑制人腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞的增殖，呈濃度和作用時(shí)間依賴性；（2）TAM聯(lián)合X射線能顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞的遷移能力，TAM能增加人腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞的放射敏感性（；3）TAM聯(lián)合X射線可顯著增加腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞的G2/M期阻滯，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡；（4）TAM能夠通過抑制PKCι的活性增加腦膠質(zhì)瘤A172和U251細(xì)胞的輻射敏感性。同時(shí)TAM能夠通過抑制Cdk7的活性進(jìn)而降低G2/M期相關(guān)蛋白cyclinB1的表達(dá)，導(dǎo)致G2/M期的阻滯增加，凋亡蛋白Bad的升高，增加caspase3活性并降低PARP的活性，增強(qiáng)X射線誘導(dǎo)的凋亡作用。（5）TAM聯(lián)合X射線能有效抑制腫瘤生長。
[Abstract]:Objective to investigate the protein kinase C (PKC) inhibitor tamoxifen (tamoxifen, TAM) and X ray on the growth of human glioma A172 cells and U251 cell cycle, apoptosis and radiosensitivity of tumor and its mechanism, construction of human glioma in nude mice, sensitized in vivo validation of TAM radiation.
Methods (1) in vitro experiment 1, detection of different concentrations of TAM MTT method, different treatment time of A172 brain glioma, proliferation of U251 cells; 2, scratches experimental observation of brain glioma A172, the migration ability of U251 cells; 3, clone forming test of TAM on brain glioma A172, the radiosensitizing effect of U251 cells the 4, TAM and X; X-ray determination of glioma A172 cells by flow cytometry, cell cycle distribution and apoptosis effect of U251 cells; 5, the protein expression of Western-blot was detected by changes in the level.
(two) in vivo: construct nude mice brain glioma orthotopic model of nude mice were randomly divided into the tumor control group, radiotherapy group, TAM group, +TAM radiotherapy group, 5 rats in each group of.MRI to assess the in situ tumor size in nude mice, mice were killed and the tumor tissue changes, immunohistochemistry and apoptosis detection in tumor tissue the protein of Bad.
Results (1) in vitro experiment: 1 TAM inhibited glioma A172 cell proliferation of U251, when the TAM concentration is 10 mol/L, the survival rate of A172 cells was 95.1%, the survival rate of U251 cells was 93.9%, and compared with the control group had no statistical significance, so the follow-up experiment research 10 mol/L concentration as the experimental concentration of.2, cell scratch test showed that TAM combined with X ray can significantly inhibit human glioma A172, U251 cell migration ability of.3, TAM and X ray irradiation of glioma cells, cell survival rate with the dose increase and decrease (P < 0.01), multi target click the model fitting dose survival curve, the mean lethal dose of A172 cells irradiated group (D0) and the quasi threshold dose (Dq) were 2.46Gy and 2.97Gy, +TAM D0 and Dq irradiation group were 1.97Gy and 2.80Gy, A172 cells radiosensitization ratio (SER) is 1.25; U251 cells alone The irradiation group D0 and Dq were 2.60Gy and 0.91Gy, +TAM D0 and Dq irradiation group were 1.78Gy and 1.34Gy, U251 cells radiosensitization ratio (SER) of 1.46.4, TAM combined with X ray to human glioma A172, U251 cells G2/M phase arrest and irreversible.5, TAM combined with X ray significantly the increase of human glioma A172, the apoptosis rate of U251 cells (P < 0.01).6, Western-blot results showed that TAM combined with X ray effect of A172 glioma cells, U251 can significantly inhibit PKC L and the activity of Cdk7, reduce the expression of cyclin cyclinB1, and apoptosis protein Bad expression was significantly increased, the increase of Caspase3 activity, decreased the activity of PARP. (two) in vivo experiment: 1 mice model of orthotopic A172 glioma cells, MRI examination results showed that the irradiation group +TAM the tumor volume was significantly smaller than the other experimental group tumor volume, immunohistochemistry showed that irradiation of tumor tissue in +TAM group Bad Up to the rise.
Conclusion (1) TAM can inhibit glioma cell proliferation of A172 and U251, in a concentration and time dependent effect; (2) the migration ability of TAM combined with X radiation can significantly inhibit human glioma A172 and U251 cells, TAM can increase the radiation sensitivity of human glioma cells (A172 and U251 3; sensibility TAM) combined with X ray can significantly increase the glioma A172 and U251 cells G2/M phase arrest and apoptosis of brain glioma cells; (4) TAM can increase the radiation sensitivity of A172 glioma and U251 cells by inhibiting PKC iota activity. TAM can also by inhibiting the activity of Cdk7 and decreased the expression of G2/M the related protein cyclinB1, resulting in a delay in G2/M phase increased, increased apoptosis protein Bad, increase the activity of Caspase3 and decreased PARP activity, enhanced apoptosis induced by X - ray. (5) TAM combined with X ray can effectively inhibit tumor growth.

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

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本文編號：1759387