本文選題：肌萎縮側(cè)索硬化 + 基因突變��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年碩士論文

【摘要】：背景肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一種致死性的神經(jīng)退行性疾病,通常累及大腦皮質(zhì)、腦干和脊髓前角的上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,導(dǎo)致肌肉無(wú)力和萎縮、言語(yǔ)困難及呼吸功能障礙。目前,全世界已發(fā)現(xiàn)的ALS致病基因主要有30余個(gè),SOD1、FUS、TARDBP和C9ORF72基因最為常見(jiàn)。其中,C9ORF72基因非編碼區(qū)的六核菅酸重復(fù)擴(kuò)增突變GGGGCC (G4C2)是西方國(guó)家ALS與額顳葉癡呆(frontotemporal dementia, FTD)的最主要原因。此外,ATXN2基因編碼區(qū)的三核苷酸(CAG)n重復(fù)擴(kuò)增也是ALS發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。目的(1)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)ALS目標(biāo)基因突變,明確ALS患者常見(jiàn)的突變基因及其突變率。(2)檢測(cè)C9ORF72基因的非編碼區(qū)G4C2突變和編碼區(qū)突變,初步分析C9ORF72基因在ALS中發(fā)揮的作用。(3)明確ATXN2, ATXN3.,, AR基因編碼區(qū)和ATXN8基因非編碼區(qū)的(CAG)n重復(fù)擴(kuò)增與ALS是否有關(guān)。方法(1)應(yīng)用Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行靶向重測(cè)序,目標(biāo)基因panel包括26個(gè)ALS明確致病基因及相關(guān)易感基因的全部外顯子區(qū)域。篩選ALS候選致病基因突變及初步分析其致病性,明確常見(jiàn)突變基因及突變頻率。(2)采用Repeat-primed PCR擴(kuò)增C9ORF72基因G4C2重復(fù)擴(kuò)增區(qū)域,使用AB13730 DNA Analyzer儀器和GeneMapper軟件分析G4C2重復(fù)次數(shù)。通過(guò)體內(nèi)cDNA測(cè)序和體外Minigene檢測(cè)兩種方法確定C9ORF72基因的剪接位點(diǎn)變異c.601-2AG的致病性。(3)擴(kuò)增ATXN2、ATXN3、ATXN8和AR基因的(CAG)n重復(fù)擴(kuò)增區(qū)域,確定(CAG)n在ALS患者和健康對(duì)照中的重復(fù)次數(shù),通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析(CAG)n重復(fù)擴(kuò)增突變與ALS是否有關(guān)。結(jié)果(1)我們?cè)?例FALS患者(38.89%,7/18)和33例SALS患者(18.54%,33/178)中檢測(cè)到36種基因突變類(lèi)型,包括1個(gè)剪接位點(diǎn)突變,1個(gè)無(wú)義突變和34個(gè)錯(cuò)義突變。FALS患者攜帶的基因突變分布在ALS明確致病基因SOD1、UBQLN2和VAPB中,其中突變頻率最高的基因?yàn)镾OD1(27.78%)。SALS患者中14例(7.87%,14/178)攜帶ALS明確致病基因的突變,SOD1突變頻率最高。其余19例SALS患者(10.67%,19/178)攜帶ALS相關(guān)基因的突變,其中頻率最高的是NEFH(3.93%)。(2)我們發(fā)現(xiàn)2例SALS患者(0.79%,2/252)攜帶C9ORF72基因的G4C2重復(fù)擴(kuò)增突變(大于30次)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示該重復(fù)擴(kuò)增突變?cè)谥袊?guó)ALS患者和健康對(duì)照中的分布情況沒(méi)有顯著性差異(p=0.805)。此外,我們發(fā)現(xiàn)了C9ORF72基因的一個(gè)剪接位點(diǎn)突變(c.601-2AG)。體內(nèi)cDNA測(cè)序及體外MiniGene實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示出該突變破壞了第4內(nèi)含子中的剪接受體位點(diǎn),使第5外顯子中隱匿剪接受體位點(diǎn)激活,可能導(dǎo)致成熟mRNA中缺失四個(gè)核苷酸(c.601_604 del ATAG),讀碼框發(fā)生移位并提前出現(xiàn)終止密碼(p.I201fsX235); cDNA測(cè)序結(jié)果還顯示出無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(Nonsense-Mediated mRNA Decay, NMD)。該突變?yōu)镃9ORF72基因編碼區(qū)突變的首次發(fā)現(xiàn),也為L(zhǎng)oss-of-Function致病機(jī)制提供新證據(jù)。(3)我們發(fā)現(xiàn)ATXN2基因的(CAG)。長(zhǎng)片段重復(fù)(≥32次)在ALS患者和正常人中分布有顯著性差異(p=0.028),而中間片段(24-31次)沒(méi)有(p=0.839)；ATXN8基因的(CAG)n中間片段(29-67次)和ALS疾病有關(guān)(p=0.0130)；ATXN3和AR基因的長(zhǎng)片段、中間片段和短片段重復(fù)均和ALS無(wú)關(guān)。結(jié)論(1)本研究發(fā)現(xiàn)FALS和SALS患者中突變頻率最高的基因均為SOD1,FALS和SLAS突變譜存在明顯差異。(2) C9ORF72基因的六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增突變G4C2不是中國(guó)ALS患者的常見(jiàn)基因突變類(lèi)型。(3)發(fā)現(xiàn)一個(gè)C9ORF72基因剪接位點(diǎn)突變c.601-2AG,為ALS的Loss-of-Function致病機(jī)制增加新證據(jù)。(4) ATXN2基因的(CAG)n長(zhǎng)片段(≥32次)和ATXN8基因的中間片段(29-67次)可能與ALS有關(guān)。ATXN3和AR基因的(CAG)n突變與ALS無(wú)關(guān)。
[Abstract]:The background of amyotrophic lateral sclerosis (amyotrophic lateral, sclerosis, ALS) is a fatal neurodegenerative disease, usually involving the cerebral cortex, brainstem and spinal cord anterior horn, motor neurons, leading to muscle weakness and atrophy, speech difficulties and respiratory dysfunction. At present, there are more than 30 ALS, the main pathogenic gene the whole world has been found in SOD1, FUS, TARDBP and C9ORF72 genes are the most common. Among them, six non nuclear acid C9ORF72 gene encoding region Kan repeat amplification mutation GGGGCC (G4C2) in western countries, ALS and frontotemporal dementia (frontotemporal dementia, FTD) of the main reason. In addition, the ATXN2 gene encoding region of trinucleotide (CAG one of the risk factors of n repeat amplification) is the pathogenesis of ALS. (1) ALS target detection using high-throughput sequencing gene mutation, clear common in patients with ALS mutation and mutation rate. (2) the detection of C9ORF72 gene Mutations encoding G4C2 mutation and encoding region, preliminary analysis of the C9ORF72 gene play a role in ALS. (3) clear ATXN2, ATXN3., AR, encoding gene and ATXN8 gene in non encoding region (CAG) of N and ALS. If the repeat amplification method (1) using Ion Torrent sequencing platform targeting weight sequencing of target gene panel, including all 26 ALS specific virulence genes and susceptibility gene exon. Screening and mutation of ALS candidate genes to analyze its pathogenicity, clear common mutation gene and mutation frequency. (2) by Repeat-primed PCR amplification of C9ORF72 gene G4C2 repeat amplification region, the use of AB13730 DNA Analyzer instrument and GeneMapper software analysis of G4C2 repeat number. To determine the pathogenicity of c.601-2AG splice site variants of the C9ORF72 gene by cDNA sequencing in vivo and in vitro Minigene two methods. (3) ATXN3, ATXN8 and ATXN2 amplification, AR based Because of the (CAG) n repeat amplification region (CAG), to determine the number of n repeats in ALS patients and healthy controls, through statistical analysis (CAG) n repeat amplification and ALS mutation is related. Results (1) in 7 FALS patients (38.89%, 7/18) and 33 SALS patients (18.54%, 33/178) was detected in 36 mutations, including 1 splice site mutations, 1 nonsense mutations and 34 missense mutations in patients with.FALS gene mutation distribution in ALS clear pathogenic gene SOD1, UBQLN2 and VAPB, the mutation frequency was the highest in SOD1 (27.78%).SALS patients in 14 cases (7.87%, 14/178) mutations in the ALS gene SOD1 mutation clearly, the highest frequency. The remaining 19 cases of patients with SALS (10.67%, 19/178) mutations in the ALS gene, which is the highest frequency of NEFH (3.93%). (2) we found 2 cases of SALS patients (0.79%, 2/252) with C9ORF72 gene G4C2 repeat amplification process Change (above 30). Statistical analysis showed no significant difference between the repeat amplification mutation distribution in Chinese in ALS patients and healthy controls (p=0.805). In addition, we found a splice site mutation of C9ORF72 gene (c.601-2AG) in vivo and in vitro. CDNA sequencing results of MiniGene showed the mutation destroy the fourth intron splice acceptor site, the exon fifth splice acceptor sites in occult activation may lead to mature mRNA four nucleotide deletion (c.601_604 del ATAG), reading frame shift and advance the termination codon (p.I201fsX235); cDNA sequencing results also showed no degradation of mRNA mediatedrna (Nonsense-Mediated mRNA, Decay, NMD). The mutation for the encoding region of C9ORF72 gene was found for the first time, but also provide new evidence for the pathogenesis of Loss-of-Function. (3) we found that the ATXN2 gene (CAG). Repeat fragment (over 32 times) in ALS patients and normal people in the distribution had significant difference (p=0.028), and the middle segment (24-31) no (p=0.839); ATXN8 gene (CAG) n middle segment (29-67) and ALS disease (p=0.0130); long ATXN3 and AR gene. The middle and short fragments repeat and ALS were unrelated. Conclusion (1) this study found that FALS and SALS in patients with the highest frequency of mutations were SOD1, FALS and SLAS mutation spectrum had obvious difference. (2) C9ORF72 gene six nucleotide repeat amplification gene mutations of G4C2 is not China patients with ALS mutation type. (3) found a C9ORF72 gene splice site mutation c.601-2AG, adding new evidence for the pathogenesis of ALS. Loss-of-Function (4) gene ATXN2 (CAG) n long fragment (over 32 times) the middle fragment and ATXN8 gene (29-67) may be associated with ALS.ATXN3 and AR (CAG) gene N mutation with no ALS Close.

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R744.8

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本文編號(hào)：1742990