本文選題：線粒體縫隙連接蛋白43　切入點：線粒體　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景:神經(jīng)血管單元由神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞三部分共同組成,此定義的提出強調(diào)了三者及其相互聯(lián)系在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要地位。縫隙連接實現(xiàn)了細胞群信息傳遞、代謝底物交換和離子平衡上的同步化,并且在神經(jīng)元興奮性、血管舒縮及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中縫隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)為縫隙連接的最主要組成成分。缺血性腦損傷主要是由于局部腦血流中斷,組織缺氧,其代謝功能無法正常運轉(zhuǎn),導(dǎo)致以神經(jīng)元為主,膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞共同組成的神經(jīng)血管單元受損,最終機體的功能受到破壞。近來發(fā)現(xiàn),在星形膠質(zhì)細胞的線粒體上也存在Cx43的表達,但是其在缺血性腦損傷過程中的變化及所扮演的角色尚未探知。鑒于線粒體在能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化等方面的重要作用,我們選擇以縫隙連接蛋白——特別是分布于線粒體內(nèi)膜上的Cx43的分布變化及功能為研究對象,擬通過分析其在缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)損傷中變化規(guī)律及作用機制,探索干預(yù)線粒體縫隙連接對神經(jīng)保護的意義,為腦梗塞的治療提供新的靶點。目的:觀察線粒體內(nèi)Cx43的分布及表達變化,分析其在腦IR損傷中變化規(guī)律,進一步探索相關(guān)作用機制,同時評價丹參多酚酸的保護作用。方法:體外實驗中,以原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞糖氧剝奪模型(oxygen glucose deprivation,OGD)為基礎(chǔ),實驗分為對照組,單純OGD組(模型組),縫隙連接通道阻斷劑—甘珀酸(carbenoxolone,CBX)干預(yù)組,線粒體ATP敏感性鉀通道激動劑—二氮嗪(diazoxide,DZX)干預(yù)組,DZX+線粒體ATP敏感性鉀通道抑制劑—5-羥奎酸(5-hydroxydecanoic acid,5-HD)干預(yù)組和丹參多酚酸(salvianolic acid,SA)干預(yù)組。首先,檢測各干預(yù)劑下細胞的相對存活率,同時分析各組細胞凋亡情況,電鏡下觀察各組細胞及細胞內(nèi)線粒體形態(tài)。進而,檢測各干預(yù)劑刺激下線粒體膜電位的變化,通過免疫熒光定位觀察星形膠質(zhì)細胞中Cx43的分布情況。體內(nèi)實驗中,選用體重約為250~290 g的雄性Wistar大鼠,采用左側(cè)大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。實驗分為假手術(shù)組(對照組)、單純IR組(模型組)、CBX干預(yù)組、DZX干預(yù)組、DZX+5-HD干預(yù)組、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制劑—Ro-31-8425+DZX干預(yù)組、PKC激動劑—佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)+5-HD干預(yù)組和SA干預(yù)組。首先,染色觀察比較各干預(yù)藥物對大鼠腦梗死面積、神經(jīng)功能學(xué)評分的作用,評價各干預(yù)藥物對大鼠腦梗塞后凋亡情況的影響,繼而觀察腦皮層梗死區(qū)線粒體形態(tài),同時通過超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的檢測評價各干預(yù)劑下線粒體功能的變化,最后對腦皮層梗死區(qū)Cx43、p-Cx43、PKC、p-PKC蛋白的表達含量進行定量,探討不同干預(yù)劑的不同作用,分析其機制。結(jié)果:1、組織、細胞形態(tài)學(xué):與單純模型組比,CBX和DZX干預(yù)組腦梗死面積明顯減小,細胞的凋亡程度降低(P0.01),且5-HD降低了DZX對梗死面積的縮小作用(P0.01);同樣與模型組相比,SA組明顯減少了梗死面積,降低了細胞凋亡程度(P0.01)。2、神經(jīng)功能學(xué)評分:與對照組比較,其余各組評分均增高(P0.01),表現(xiàn)為梗塞區(qū)對側(cè)的肢體肌力降低,但除對照組外,其余各組之間評分無顯著差異。3、線粒體形態(tài)及功能:線粒體形態(tài)方面,與對照組相比,其余各組腦皮層梗死區(qū)線粒體形態(tài)損傷明顯,主要表現(xiàn)為線粒體腫脹,棘斷裂,基質(zhì)透明化,其中單純模型組和DZX+5-HD組線粒體損傷較明顯(P0.05);線粒體功能方面,與假手術(shù)組比較,單純模型組可見明顯的SOD活力減低、MDA含量增高(P0.01),而CBX、DZX、PMA、SA干預(yù)劑皆能一定程度上提高SOD活力、降低MDA含量(P0.05),對線粒體功能起到保護作用。4、Cx43定位與定量:與對照組比,單純OGD組星形膠質(zhì)細胞整體Cx43含量減低,特別是細胞膜上分布含量減低,而細胞內(nèi)Cx43的含量趨近增多,并且可見線粒體與Cx43共定位;在線粒體蛋白定量中,與假手術(shù)組比,模型組腦皮層梗死區(qū)線粒體Cx43、p-Cx43含量明顯減低(P0.01),而p-Cx43降低更為明顯(P0.01),在CBX、DZX、PMA、SA干預(yù)調(diào)節(jié)下,與IR組比,線粒體Cx43、p-Cx43明顯升高(P0.05),且p-Cx43增高更為明顯(P0.05)。結(jié)論:線粒體Cx43可以在腦IR損傷中起到保護神經(jīng)血管單元的作用,這種保護作用是通過線粒體ATP敏感性鉀通道調(diào)節(jié)PKC活性實現(xiàn)的,并且線粒體Cx43也參與了丹參多酚酸對腦IR損傷的保護過程。
[Abstract]:Background: the neurovascular unit consists of neurons, glial cells and vascular endothelial cells composed of three parts together, the proposed definition emphasizes the importance of the three and their relationship in the nervous system. The gap junction cell group information transmission, synchronization of metabolic substrate exchange and ion balance, and neuronal excitability homeostasis, vasomotor and play an important role in regulating the gap. In the nervous system of connexin 43 (connexin43, Cx43) is the main composition of gap junctions. Ischemic brain damage is mainly due to local cerebral blood flow interruption, tissue hypoxia, metabolic dysfunctional, leading to neuronal. The neurovascular unit glial cells and vascular endothelial cells composed of damaged body, eventually destroyed function. Recently, in astrocyte mitochondria also The expression of Cx43, but in the process of ischemic brain injury and the change of the role has not been penetrated. In view of the mitochondria in energy metabolism, signal transduction, protein phosphorylation plays an important role, we choose the distribution and change of function in connexin -- especially in the distribution of mitochondria membrane Cx43 as the research object, through the analysis in the ischemia reperfusion (ischemia-reperfusion, IR) changes and mechanism of injury, explore the involvement of mitochondrial gap junction on the neuroprotective significance, provide a new target for the treatment of cerebral infarction. Objective: To observe the distribution and expression of mitochondrial Cx43, analyze its changes in the IR of brain injury, to further explore the mechanism, and to evaluate the protective effect of salvianolic acid. Methods: in vitro, the astroglia cells cultured in oxygen glucose deprivation. Type (oxygen glucose deprivation, OGD) as the basis, the experiment was divided into control group, OGD group (model group), a gap junction blocker - carbenoxolone (carbenoxolone, CBX) intervention group, mitochondrial ATP sensitive potassium channel agonist - two diazoxide (diazoxide, DZX) intervention group, DZX+ of mitochondrial ATP sensitive potassium channel inhibitor 5- hydroxyl acid (5-hydroxydecanoic acid, qui 5-HD) intervention group and salvianolate (salvianolic acid SA) intervention group. First of all, to detect the intervention agents cell survival rate, cell apoptosis was also analysis, observe the mitochondrial morphology of each cell and cell in electron microscope. Then, change detection the intervention agent under the stimulation of mitochondrial membrane potential, by immunofluorescence to observe the distribution of Cx43 in astrocytes. In vivo, the weight is about 250~290 g in male Wistar rats by left middle cerebral artery (middle cerebral artery occlusion, embolization MCAO). Model rats were divided into sham operation group (control group), IR group (model group), CBX group, DZX group, DZX+5-HD group, protein kinase C (protein kinase C, PKC) - Ro-31-8425+DZX inhibitor intervention group, PKC - agonist phorbol ester (phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA) +5-HD intervention group and SA intervention group. First of all, the drug intervention was observed on cerebral infarction area in rats, the neurological scores of the evaluation of the impact of the intervention effect of drugs on apoptosis after cerebral infarction in rats, and then observe the cerebral cortex infarction region of mitochondrial morphology, the superoxide dismutase enzyme (superoxide dismutase, SOD) activity and malondialdehyde (malondialdehyde, MDA) were detected to evaluate the intervention changes of mitochondrial function agent, at the end of the cerebral infarct zone in Cx43, p-Cx43, PKC, p-PKC protein expression containing The amount of quantitative, to explore the different effects of different intervention agents, analysis of its mechanism. Results: 1, tissue, cell morphology and simple model group, CBX intervention group and DZX cerebral infarction area was decreased, the degree of apoptosis cells decreased (P0.01), and the decrease of 5-HD to reduce the effect of DZX on infarct size (P0.01) the same; compared with the model group, SA group significantly reduced infarct size, reduced the degree of apoptosis (P0.01).2, neurological score: compared with the control group, the other groups were increased (P0.01), decreased the contralateral limb muscle strength in infarction area, but in addition to the control group, the other groups between there were no significant differences in.3, mitochondrial morphology and mitochondrial morphology and function: compared with the control group, the infarct area of each cerebral cortex mitochondria injury obviously, mainly for mitochondrial swelling, spine fracture, matrix transparent, simple model group and DZX+5 -HD group of mitochondrial damage is obvious (P0.05); mitochondrial function, compared with the sham group, pure model group showed obvious SOD activity decreased, MDA content increased (P0.01), CBX, DZX, PMA, SA all intervention agents can improve the activity of SOD, decrease the content of MDA (P0.05), to the protective effect of.4 on mitochondrial function, Cx43 positioning and quantitative: compared with control group, OGD group decreased astrocyte overall Cx43 content, especially the content distribution to reduce the cell membrane, and intracellular Cx43 content reaching increased, and the co localization of Cx43 and mitochondria; mitochondrial proteins in quantitative, and sham operation group than in model group, cerebral cortex infarction area of mitochondrial Cx43, p-Cx43 were significantly decreased (P0.01), and p-Cx43 was significantly lower (P0.01), CBX, DZX, PMA, SA intervention, compared with group IR, mitochondrial Cx43, p-Cx43 increased significantly (P0.05), and higher p-Cx43 (obviously P0.05). Conclusion: mitochondrial Cx43 can play a protective role in the IR damage of brain, which is mediated by mitochondrial ATP sensitive potassium channel to regulate PKC activity. Mitochondrial Cx43 is also involved in the protective process of salvianolic acid on brain IR injury.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743

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本文編號：1729526