本文選題：大麻素Ⅰ型受體　切入點(diǎn)：星形膠質(zhì)細(xì)胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景 大麻素Ⅰ型受體（cannabinoid type1receptor, CB1R）是一類廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前膜的G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor, GPCR），感受突觸后逆向分泌的內(nèi)源性大麻素(endogenous cannabinoid, EC)，抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放，從而調(diào)控突觸傳遞乃至神經(jīng)元興奮性，在癲癇發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用。但是目前關(guān)于CB1R在癲癇中的作用尚無統(tǒng)一的結(jié)論。有研究報(bào)道CB1R激動(dòng)劑可以抑制癲癇發(fā)作，但也有文獻(xiàn)報(bào)道CB1R激動(dòng)劑可以促進(jìn)癲癇發(fā)作。這些矛盾的研究結(jié)果提示，很可能存在突觸以外尚未被發(fā)現(xiàn)的CB1R表達(dá)，具有和突觸上CB1R不同的調(diào)控機(jī)制。最新報(bào)道提示，星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte,AST）上存在CB1R，并且在維持大鼠海馬癲癇樣放電中發(fā)揮重要作用。但星形膠質(zhì)細(xì)胞上的CB1R是否參與了慢性癲癇發(fā)生，特別是藥物難治性癲癇的發(fā)生機(jī)制，尚無明確結(jié)論。因此，我們對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R在顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy, TLE），一種常見的藥物難治性癲癇，的發(fā) 生過程中的作用機(jī)制進(jìn)行探討。目的 觀察顳葉癲癇患者硬化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞CB1R的表達(dá)特點(diǎn)，進(jìn)而明確顳葉癲癇發(fā)生過程中星形膠質(zhì)細(xì)胞CB1R時(shí)空表達(dá)特征及超微結(jié)構(gòu)，最后探討CB1R是否參與活化狀態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞的促興奮機(jī)制。 方法 首先收集15例顳葉癲癇患者及5例急性腦外傷患者手術(shù)切除的海馬組織分別作為癲癇組和對(duì)照組，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，觀察硬化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R的表達(dá)特征；依據(jù)TLE硬化海馬組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞的CB1R表達(dá)高低將患者分為陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組，對(duì)兩組患者的年齡、發(fā)病年齡、病程、平均發(fā)作持續(xù)時(shí)間、平均發(fā)作頻率等臨床指標(biāo)進(jìn)行比較，將具有顯著性差異的指標(biāo)和星形膠質(zhì)細(xì)胞CB1R的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析；然后制作鋰匹羅卡品大鼠癲癇模型，模擬TLE發(fā)生過程和海馬硬化，分別在癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus, SE）后3天和4周應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)和激光共聚焦顯微鏡檢測海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R表達(dá)；在SE后4周通過免疫電鏡對(duì)硬化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上的CB1R進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察；最后體外進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)，用促炎物質(zhì)脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，模擬TLE海馬硬化時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化；使用TUNNEL法檢測細(xì)胞凋亡，MTT法檢測細(xì)胞存活率；利用免疫細(xì)胞化學(xué)和激光共聚焦技術(shù)檢測LPS干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞的CB1R分布變化，并利用Western Blot檢測LPS干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R的表達(dá)改變；對(duì)LPS處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞和未處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)給與CB1R激動(dòng)劑WIN552122干預(yù)，應(yīng)用高效液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC MS/MS）檢測兩組細(xì)胞外液中的谷氨酸濃度，同時(shí)使用激光共聚焦顯微鏡鈣成像技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。 結(jié)果 （1）在對(duì)臨床標(biāo)本的研究中，對(duì)照組所有患者海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞上沒有檢測到CB1R表達(dá)，而在TLE患者硬化海馬組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞上有9例檢測到CB1R表達(dá)，6例沒有檢測到CB1R表達(dá)； （2）星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R表達(dá)陽性和陰性的兩組TLE患者的平均每月發(fā)作次數(shù)存在顯著性差異，且相關(guān)性分析顯示硬化海馬表達(dá)CB1R的星形膠質(zhì)細(xì)胞的陽性率和癲癇發(fā)作頻率存在正相關(guān)； （3）在動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)中，生理鹽水對(duì)照組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞上沒有檢測到CB1R表達(dá)，而癲癇組大鼠在SE后3天CB1R就已經(jīng)開始表達(dá)于部分海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，SE后4周時(shí)大鼠海馬表現(xiàn)出神經(jīng)元丟失和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，且?guī)缀跛行切文z質(zhì)細(xì)胞呈CB1R陽性表達(dá)； （4）SE后4周的超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞極少出現(xiàn)CB1R表達(dá)，但是在硬化海馬增生肥大的星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R表達(dá)明顯，并且部分CB1R表達(dá)于增生肥大星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上； （5）在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，LPS干預(yù)導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，，同時(shí)其CB1R表達(dá)增多，并且分布從細(xì)胞核周圍向遠(yuǎn)離細(xì)胞核方向移動(dòng)； （6）CB1R激動(dòng)劑WIN552122引起LPS干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞內(nèi)Ca2+熒光值增加幅度明顯高于正常對(duì)照增加的幅度，同時(shí)，WIN552122引起LPS干預(yù)細(xì)胞外液中谷氨酸濃度明顯增加，且明顯高于正常對(duì)照增加的幅度。 結(jié)論 部分TLE患者硬化海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞存在CB1R表達(dá)，且CB1R陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的百分率與發(fā)作頻率存在直接聯(lián)系，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R可能與癲癇形成存在聯(lián)系；通過動(dòng)物模型模擬顳葉癲癇發(fā)生過程，星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R表達(dá)明顯升高且存在上膜改變，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R可能參與了癲癇發(fā)生的機(jī)制；進(jìn)一步的離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活化狀態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上CB1R功能提高，升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，釋放谷氨酸的能力明顯增強(qiáng)，提示CB1R可能是通過增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的促興奮作用而參與癲癇發(fā)生的機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.1

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本文編號(hào)：1728825