本文選題：OXR1A　切入點(diǎn)：iPSCs　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的和意義:神經(jīng)系統(tǒng)疾病是人類的常見病和多發(fā)病,但許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明,同時也缺乏對這些疾病治療的有效方法。近年來,將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSCs)應(yīng)用于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療研究已成為神經(jīng)系統(tǒng)研究領(lǐng)域最活躍的組成部分,給神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療帶來了希望。iPSCs是將體細(xì)胞重編程而獲得的多潛能干細(xì)胞,具有自我更新及多向分化的潛能,可運(yùn)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型建立、藥物篩查及移植治療等多個方面。將iPSCs定向分化為神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞是iPSCs在神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)用的前提。到目前為止,雖然iPSCs可以在體外成功分化成為運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞,多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞等,但是我們對于iPSCs神經(jīng)定向分化的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確,對影響iPSCs神經(jīng)定向分化的相關(guān)因素及調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步的研究�？寡趸�1(oxidationresistancegene1,oxr1)是2000年發(fā)現(xiàn)的一個保守基因家族,在真核生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的抗氧化作用。此外有研究發(fā)現(xiàn)oxr1還具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,延長肌萎縮側(cè)索硬化癥小鼠模型生存期的作用。人類和小鼠oxr1都具有四個rna轉(zhuǎn)錄亞型,分別為oxr1a,oxr1b,oxr1c,oxr1d,且oxr1a只在人類和小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,cns)中表達(dá)。這種oxr1a的表達(dá)特性提示oxr1a可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育或者功能具有密切關(guān)系。結(jié)合oxr1在細(xì)胞里重要的抗氧化功能,我們推測oxr1a可能影響ipscs的增殖和神經(jīng)定向分化功能。在前期工作中,我們的研究團(tuán)隊(duì)已成功地利用基因捕獲技術(shù)建立了oxr1a基因敲除小鼠模型,本課題在此基礎(chǔ)上,將oxr1a基因敲除小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryonicfibroblasts,mefs)重編程成為ipscs。通過建立了oxr1a基因敲除的ipscs細(xì)胞模型,以研究oxr1a對于ipscs的增殖以及神經(jīng)定向分化能力的影響及可能的相關(guān)機(jī)制。方法:在第一部分實(shí)驗(yàn)中,首先通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將oct4、sox2及klf4轉(zhuǎn)染至oxr1a基因敲除的mefs中,將其重編程為ipscs,再通過基因型鑒定以驗(yàn)證oxr1a基因敲除ipscs細(xì)胞模型的建立。其次,進(jìn)行干細(xì)胞蛋白標(biāo)記物nanog、rex1、oct4及sox2的免疫熒光染色、堿性磷酸酶染色及將ipscs隨機(jī)分化后進(jìn)行外胚層標(biāo)記物tuj1,中胚層標(biāo)記物sma,內(nèi)胚層標(biāo)記物afp的免疫熒光染色以定性驗(yàn)證ipscs。此外,我們還通過實(shí)時熒光定量pcr(realtimequantitativepcr,qpcr)檢測了干細(xì)胞蛋白標(biāo)記物nanog、rex1、oct4及sox2的表達(dá)水平、oxr1及oxr1a在ipscs隨機(jī)分化模型中表達(dá)量的變化。在第二部分實(shí)驗(yàn)中,首先利用mtt檢測細(xì)胞相對活性的方法,繪制了ipscs增殖曲線以檢測oxr1a對于ipscs增殖能力的影響,還檢測了在不同濃度的過氧化氫處理后野生型和oxr1a基因敲除型ipscs內(nèi)細(xì)胞相對活性的變化。同時還通過qpct檢測ipscs線粒體dna編碼的相關(guān)基因(12s、nd1、nd3、cytb及cox1)的表達(dá)水平、dna拷貝數(shù)以了解線粒體功能的變化;此外運(yùn)用qpcr定量測定dna損傷檢測法(real-timeqpcranalysisofdamgesfrequency,radf)檢測ipscs的線粒體和核dna損傷水平的變化,以檢測oxr1a對于ipscs的線粒體和核dna損傷的影響;最后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定了ipscs細(xì)胞周期的變化及通過qpcr測定了ipscs內(nèi)抗氧化功能相關(guān)基因(p21、nrf2、gpx2、p53、caspas9、caspas3、foxo1、foxo3、dusp1及fos)表達(dá)水平,以探求oxr1a對于ipscs增殖影響的可能機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)第三部分,利用noggin誘導(dǎo)ipscs定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells,nscs),通過aggrewell培養(yǎng)盤法定量比較神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)球的的形成率;進(jìn)一步利用分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)nscs分化成神經(jīng)細(xì)胞,通過qpcr法比較野生型及oxr1a基因敲除型nscs分化后神經(jīng)標(biāo)記物基因(gfap、map2、nestin、pax6、sox1和tuj1)的變化,并通過對分化后的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行tuj1免疫熒光染色,檢測了oxr1a對ipscs分化成神經(jīng)元數(shù)目的影響。通過直接測量野生型及oxr1a基因敲除型神經(jīng)球的直徑和計(jì)算神經(jīng)球的數(shù)量檢測oxr1a對于由ipscs誘導(dǎo)的形成神經(jīng)球大小及增殖速度的影響。此外通過mtt法檢驗(yàn)了nscs增殖能力和抗氧化能力的變化。通過流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測ipscs的ros的表達(dá)水平,檢測oxr1a基因敲除型ipscs內(nèi)ros水平的變化。最后,為進(jìn)一步了解oxra對于ipscs神經(jīng)定向分化影響的可能機(jī)制,我們通過qpcr方法檢測了ipscs神經(jīng)分化后抗氧化功能相關(guān)基因(p21、nrf2、gpx2、p53、caspas9、caspas3、foxo1、foxo3、dusp1及fos)核酸表達(dá)水平的變化。結(jié)果:第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過基因型鑒定顯示野生型ipscs和oxr1a基因敲除型ipscs具有不同的基因型,確認(rèn)了oxr1a基因敲除ipscs細(xì)胞模型建立成功。野生型ipscs和oxr1a基因敲除型ipscs干細(xì)胞標(biāo)記物nanog、rex1、oct4及sox2免疫熒光染色、ap染色均為陽性,nanog、rex1、oct4及sox2基因表達(dá)比mefs明顯增高,以上結(jié)果顯示oxr1a基因敲除后不影響mefs重編程為ipscs。此外,我們發(fā)現(xiàn)oxr1和oxr1a的表達(dá)量在ipscs隨機(jī)分化模型中隨著分化而逐漸增加。第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與野生型ipscs相比較,oxr1a基因敲除型ipscs增殖能力減弱,抗氧化能力下降,其線粒體dna拷貝數(shù)比野生型ipscs數(shù)值低,流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)oxr1a基因敲除型ipscs內(nèi)g1期細(xì)胞比率比野生型ipscs明顯增加;我們還發(fā)現(xiàn)oxr1a缺失引起ipscs內(nèi)過氧化氫酶gpx2表達(dá)的降低,p53及caspase9表達(dá)增加。但我們未發(fā)現(xiàn)ipscs的線粒體dna編碼相關(guān)基因表達(dá)及線粒體和核dna損傷出現(xiàn)明顯變化;以上結(jié)果表明oxr1基因敲除會導(dǎo)致ipscs的增殖能力的降低,其機(jī)制與oxr1a基因敲除后會導(dǎo)致ipscs內(nèi)p53表達(dá)增加,過氧化物酶gpx2表達(dá)的降低,進(jìn)一步引起caspase9表達(dá)增加,抗氧化能力下降及細(xì)胞周期改變有關(guān)。第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果:利用Noggin方法成功誘導(dǎo)野生型和OXR1A基因敲除型iPSCs分化為NSCs,但OXR1A基因敲除型iPSCs誘導(dǎo)形成NSCs的神經(jīng)球效率比野生型iPSCs低,進(jìn)一步向神經(jīng)細(xì)胞分化后OXR1A缺失會導(dǎo)致TuJ1表達(dá)降低以及在分化第7及14天TUJ1陽性神經(jīng)元數(shù)量的減少,表明了OXR1A基因敲除會降低iPSCs分化為NSCs及進(jìn)一步分化為神經(jīng)元細(xì)胞的能力。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),OXR1A基因敲除型iPSCs誘導(dǎo)形成NSCs的神經(jīng)球比野生型體積稍小及數(shù)量較少,其增殖能力及抗氧化能力降低。另外,通過流式細(xì)胞儀檢測ROS方法,我們還發(fā)現(xiàn)OXR1A基因敲除型iPSCs內(nèi)ROS水平在內(nèi)源性氧化壓力和在外源性氧化壓力存在的條件下都比野生型iPSCs增高。最后,通過比較野生型及OXR1A基因敲除型細(xì)胞在iPSCs、NSCs及神經(jīng)細(xì)胞三個不同狀態(tài)相抗氧化作用的反應(yīng)酶系統(tǒng)的表達(dá)差異,我們發(fā)現(xiàn)在iPSCs階段,OXR1A基因敲除會導(dǎo)致iPSCs內(nèi)Gpx2的降低,p53及caspase9的升高;在NSCs階段,OXR1A基因敲除會引起NSCs內(nèi)Ho-1的降低和p53的升高;在神經(jīng)細(xì)胞分化階段,OXR1A基因敲除會導(dǎo)致p21,FOXO3及Dusp1的降低和caspase9的升高。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OXR1A基因缺失會導(dǎo)致iPSCs增殖及神經(jīng)定向分化能力的下降,證明了OXR1A在iPSCs增殖及神經(jīng)定向分化中具有重要作用。OXR1A對iPSCs增殖及神經(jīng)定向分化調(diào)節(jié)的機(jī)制為:OXR1A缺失后可能通過p53/p21信號通路降低Gpx2、Ho-1,Dusp1及FOXO3等抗氧化物酶的表達(dá),引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增高而誘發(fā)了氧化應(yīng)激及改變了iPSCs的細(xì)胞周期從而影響了iPSCs的增殖和分化能力。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741

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本文編號：1728274