本文選題：肌萎縮側索硬化　切入點：腺相關病毒　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：肌萎縮側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種中年起病的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,大部分患者在診斷后的3-5年內死于呼吸衰竭。該病選擇性地損傷大腦皮層、腦干及脊髓的運動神經(jīng)元,從而導致臨床表現(xiàn)為肌肉萎縮以及肌肉無力。盡管約90%為散發(fā)病例,銅/鋅超氧化物歧化酶1(Cu2+/Zn2+superoxide dismutase,SOD1)基因突變仍是最為熟知的家族性肌萎縮側索硬化的病因,并且攜帶人類突變的SOD1-G93A基因的小鼠已經(jīng)被普遍地應用于肌萎縮側索硬化治療及病因探索上來。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)一直以來作為生理及病理情況下血管生成的重要因素而廣泛研究,近年來許多研究證實其對運動神經(jīng)元存在確定的保護作用,其在ALS中的重要作用也引起了廣泛關注。許多不同的載體及給藥途徑被用于轉運VEGF至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Azzouz等人應用慢病毒作為載體通過肌肉注射的方式將VEGF轉運至神經(jīng)元,并發(fā)現(xiàn)該方法可以有效地延長ALS鼠的生存期。也有研究通過側腦室注射(Intracerebroventricular,ICV)的方式將VEGF蛋白或者是以腺相關病毒血清4型(Adeno-associated virus 4,AAV4)為載體的VEGF基因轉運至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。另外也有研究通過鞘內注射的方式將過表達VEGF的神經(jīng)干細胞移植至SOD1-G93A轉基因小鼠。這些不同的給藥方式均可以延長ALS小鼠的生存期。然而,我們希望進一步提高VEGF的轉導效率,尋找更有效的給藥途徑和方式。已有研究表明以巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)為啟動子的AAV9載體于脊髓的運動神經(jīng)元中表達最強,而鞘內注射雖然為有創(chuàng)操作,但是其具有用量小,脫靶效應小的優(yōu)點,因此本研究中我們構建以CMV為啟動子的AAV9載體通過鞘內注射的方式來轉運VEGF,從而提高其轉染效率,進而觀察VEGF對ALS小鼠生存期的影響。ALS的發(fā)病機制尚不清楚,許多復雜的分子及細胞水平機制都可以導致運動神經(jīng)元變性。盡管多數(shù)研究都將關注點放在了運動神經(jīng)元損傷,近年來許多研究發(fā)現(xiàn)非神經(jīng)元細胞也參與其發(fā)病機理并影響疾病的病情進展。這種非細胞自身的毒性對運動神經(jīng)元的死亡至關重要。小膠質細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的固有免疫細胞是加速疾病進展的重要因素,并且在炎癥反應過程中也發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)選擇性地抑制ALS小鼠小膠質細胞中的重要的炎癥調控因子NF-k B可以明顯的減少運動神經(jīng)元的死亡。而活化的小膠質細胞又可以根據(jù)刺激因子及周圍環(huán)境的不同分為經(jīng)典活化型(M1型)與選擇活化型(M2)兩種分型。在疾病早期,起到神經(jīng)保護作用的M2型小膠質細胞為主,而隨著疾病進展在疾病快速進展期,由于許多細胞因子如腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1(Interleukin-1,IL-1)、γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)等的產(chǎn)生,小膠質細胞逐漸以促炎的M1型為主。因此,本研究在以往VEGF作用機制研究的基礎上,進一步探索其對ALS小鼠小膠質細胞增生及神經(jīng)炎癥的作用,以求進一步了解VEGF對神經(jīng)元的保護作用機制。第一部分鞘內注射scAAV9-VEGF-165對ALS小鼠生存期及行為學的影響目的:驗證改良后的鞘內注射方式是否可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效地表達目的基因;構建以CMV為啟動子的攜帶VEGF-165治療基因的scAAV9載體,并通過改良簡化的鞘內注射方式干預90天的雌性及雄性ALS小鼠,觀察ALS小鼠生存期及行為學的改變。方法:1構建以CMV為啟動子的scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP病毒載體,經(jīng)純化透析后,通過PCR技術驗證病毒滴度。2我們選取美國Jackson實驗室的SOD1G93A小鼠為動物模型,并在恒定溫度、恒定濕度且無特殊病原菌的動物房中飼養(yǎng)、繁殖。改良的簡化鞘內注射方式:小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后,用透氣紗布覆蓋小鼠頭部及軀干上部,并用拇指及食指固定小鼠髂骨部位,減去腰部毛發(fā)暴露中線位置。酒精消毒皮膚后,用漢密爾頓微量注射器在髂骨中線部位以70-80°進針,感受到脊柱骨面后將進針角度減少至30°并嘗試滑入椎間隙(L5-6)。小鼠出現(xiàn)側向甩尾或是尾巴呈現(xiàn)“S”形可以作為進入蛛網(wǎng)膜下腔的標記。3小鼠經(jīng)簡化的鞘內注射方式給予scAAV9-GFP(1 x 109 vg/g)干預三周后,分別將小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材或直接新鮮取材,通過免疫熒光及蛋白印跡技術觀察綠色熒光蛋白的表達及分布特點,驗證改良的鞘內注射方式是否可以有效的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達目的基因蛋白。4采用簡化的鞘內注射方式分別干預90天雌性及雄性的ALS小鼠。將同窩的、體重相近的90天雌性及雄性的ALS小鼠隨機的分為兩組,通過簡化的鞘內注射方式按體重分別給予scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP(1μl/g),每組各15只。觀察給藥組及對照組的生存期并記錄其體重,同時通過腳印分析、轉輪及神經(jīng)功能評分來評估ALS小鼠的運動功能,從而觀察VEGF對ALS小鼠的治療作用。結果:1構建的scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP載體經(jīng)PCR檢測病毒滴度為1×1012 vg/ml;2鞘內注射scAAV9-GFP三周后,免疫熒光結果顯示綠色熒光蛋白主要在脊髓前角表達,并可以與Neu N標記的神經(jīng)元共定位。免疫印跡結果表明,通過我們改良后的簡易的鞘內注射方式給予scAAV9-GFP后,綠色熒光蛋白可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達,包括脊髓、小腦、皮層,并且以脊髓分布為主;3經(jīng)scAAV9-VEGF-165鞘內注射干預的雌性ALS小鼠較對照組生存期延長13天(P㩳0.01),雄性小鼠生存期延長12天(P㩳0.01),雌性、雄性之間的天數(shù)區(qū)別沒有統(tǒng)計學差異。在早期,GFP對照組小鼠的體重相較于VEGF給藥組小鼠偏低,但是這種差別并沒有統(tǒng)計學意義,直到121天(雌鼠)和129天(雄鼠)時,GFP對照組小鼠的體重與VEGF-165給藥組小鼠的體重差異才存在統(tǒng)計學差異。腳印分析表明在小鼠110天時,對照組表現(xiàn)出更明顯的步態(tài)異常以及步長變短的情況。在轉輪實驗中,VEGF-165給藥組雌、雄小鼠的表現(xiàn)均較對照組好。同時,給予VEGF-165后可以延緩小鼠神經(jīng)功能評分的降低。另外,我們通過對小鼠腓腸肌的HE染色發(fā)現(xiàn),GFP對照組小鼠肌肉萎縮更加明顯,HE染色可見角型萎縮及核中心移位。第二部分鞘內注射VEGF通過其抗凋亡作用保護運動神經(jīng)元目的:觀察鞘內注射scAAV9-VEGF-165后的ALS小鼠較對照組脊髓運動神經(jīng)元數(shù)目及形態(tài)的變化,并對其神經(jīng)保護機制進行研究。方法:1我們選取美國Jackson實驗室的SOD1G93A小鼠為動物模型,并在恒定溫度、恒定濕度且無特殊病原菌的動物房中飼養(yǎng)、繁殖。隨機將6組90天ALS小鼠給予鞘內注射scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP,3周后分別將小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材(3組)或直接新鮮取材(3組)。2通過免疫組化染色計數(shù)VEGF-165給藥組及GFP對照組SMI-32陽性細胞數(shù),并觀察VEGF-165給藥組及GFP對照組運動神經(jīng)元形態(tài)變化。3通過原位末端標記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP end-labeling,TUNEL)檢測VEGF-165給藥組及GFP對照組小鼠腰髓細胞凋亡情況,并進一步通過免疫印跡技術檢測VEGF-165給藥組及GFP對照組小鼠PI3K/Akt信號通路的改變及抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的水平變化。結果:1免疫組化結果顯示110天取材的VEGF-165治療組小鼠的腰髓SMI-32陽性細胞數(shù)較GFP對照組小鼠明顯保留(8.8±1.96個/層vs.6.2±1.3個/層,P㩳0.05),且運動神經(jīng)元形態(tài)更加完整;2TUNEL檢測結果表明VEGF-165治療組小鼠腰髓TUNEL陽性的細胞數(shù)較對照組明顯減少(24.8±8.2%vs.44.5±14.4%,P㩳0.05);3給予scAAV9-VEGF-165鞘內注射3周后,小鼠腰髓VEGF-165水平明顯升高約2倍,通過免疫印跡技術檢測發(fā)現(xiàn)VEGF-165治療組小鼠脊髓PI3K/Akt信號通路激活,PI3K/Akt水平較對照組升高,且活化的caspase-9及caspase-3水平降低(P㩳0.05)。同時,與GFP對照組相對比,VEGF-165治療組小鼠的脊髓中抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高而促凋亡蛋白Bax水平下降(P㩳0.05)。第三部分VEGF治療減少ALS小鼠脊髓膠質細胞增生并調節(jié)小膠質細胞分化目的:觀察鞘內注射scAAV9-VEGF-165后的ALS小鼠較對照組脊髓小膠質細胞及星形膠質細胞數(shù)目及形態(tài)的變化,并探討VEGF對小膠質細胞分型及神經(jīng)炎癥的影響。方法:1我們選取美國Jackson實驗室的SOD1G93A小鼠為動物模型,并在恒定溫度、恒定濕度且無特殊病原菌的動物房中飼養(yǎng)、繁殖。隨機將6組90天ALS小鼠給予鞘內注射scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP,3周后分別將小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材(3組)或直接新鮮取材(3組)。2通過免疫組化染色計數(shù)VEGF-165給藥組及GFP對照組GFAP及Iba1陽性細胞數(shù),并觀察VEGF-165給藥組及GFP對照組星形膠質細胞及小膠質細胞形態(tài)變化,另外通過免疫印跡技術觀察VEGF治療組小鼠及對照組小鼠脊髓CD11b及GFAP水平的差異。3通過免疫熒光技術觀察VEGF治療組、GFP對照組ALS小鼠及陰性對照鼠脊髓CD68的表達及其與Iba1共定位的情況,另外通過PCR技術分析研究VEGF治療組、GFP對照組ALS小鼠及陰性對照鼠脊髓中CD68、TNF-α、IL-1β、Arginase-1以及Ym-1m RNA水平的差異,并通過免疫印跡技術觀察VEGF治療組、GFP對照組ALS小鼠及陰性對照鼠脊髓中CD68、TNF-α、Arginase-1及轉化生長因子(Transforming growth factor beta,TGF-β)蛋白水平的差異。結果:1免疫組化結果顯示110天取材的GFP對照組小鼠的腰髓GFAP(311±46個/層vs.163±17.61個/層,P㩳0.05)及Iba1陽性細胞數(shù)(383±19.15個/層vs.218.3±28.02個/層,P㩳0.05)較VEGF治療組小鼠增生明顯,且膠質細胞形態(tài)更為肥大。免疫印跡結果表明VEGF治療組小鼠較GFP對照組小鼠脊髓中CD11b及GFAP蛋白水平明顯降低(P㩳0.05),與免疫組化結果一致;2免疫熒光結果表明陰性小鼠脊髓CD68陽性細胞數(shù)很少,而GFP對照組ALS小鼠CD68陽性細胞數(shù)明顯增多,而給予VEGF治療后CD68陽性細胞數(shù)明顯減少,同時CD68陽性細胞可以與Iba1標記的小膠質細胞共標記;3PCR結果表明給予VEGF治療后的ALS小鼠脊髓中M1型小膠質細胞標記物(CD68、TNF-α、IL-1β)的水平較對照組降低(P㩳0.05),而M2型小膠質細胞標記物(Arginase-1及Ym-1)的水平有所升高(P㩳0.05);4免疫印跡結果顯示與PCR結果一致,即VEGF治療后可以提高ALS小鼠脊髓中Arginase-1的水平,并減少CD68、TNF-α蛋白的表達,同時可以使TGF-β水平升高,而TGF-β可以促進小膠質細胞轉化為M2型。結論:1本研究采用了改良后簡化的鞘內注射手法干預小鼠,并構建了以CMV為啟動子的scAAV9病毒載體,通過該方法給予scAAV9-GFP后,發(fā)現(xiàn)目的蛋白可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達,并主要表達于脊髓前角運動神經(jīng)元,從而證實該方法的可操作性,為下一步進行VEGF干預治療提供依據(jù)。2與以往研究結論一致,我們采用改良后的鞘內注射方式給予ALS小鼠scAAV9-VEGF治療后,雌性及雄性小鼠生存期均較對照組延長,且運動功能明顯改善,進一步肯定了VEGF對ALS的治療作用。3VEGF治療后ALS小鼠脊髓神經(jīng)元得以保留,我們進一步證實了其神經(jīng)保護作用得益于PI3K/Akt信號通路的激活,促凋亡蛋白水平降低而抗凋亡蛋白水平升高。4小膠質細胞增生在ALS發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,我們研究得出VEGF治療后可以有效減少ALS小鼠脊髓膠質細胞增生,并能調節(jié)小膠質細胞分型。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R744.8

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 孫斌;曹起龍;;鞘內注射藥物發(fā)生意外5例分析[J];人民軍醫(yī);1986年12期

2 趙英豪;超常量MTX鞘內注射致昏迷、抽搐搶救成功一例[J];中華血液學雜志;1994年07期

3 盧發(fā)森;鞘內注射過量鏈霉素致急性昏迷1例[J];中國實用內科雜志;2003年07期

4 陳美;鞘內注射化療的護理[J];交通醫(yī)學;2003年05期

5 丁現(xiàn)超;鄧建中;夏玉彬;張琰;孟君霞;李新剛;;鞘內注射甲氨蝶呤致嚴重化學性腦膜炎四例分析[J];中國藥物與臨床;2007年09期

6 趙立雙;郝長來;;鞘內注射甲氨蝶呤致神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應1例[J];山東醫(yī)藥;2006年19期

7 王建國;鞘內注射齊考諾泰治療癌癥或艾滋病疼痛有效[J];新醫(yī)學;2004年06期

8 唐靜;王育琴;;長春新堿誤行鞘內注射致嚴重神經(jīng)損害及預防[J];藥物不良反應雜志;2007年06期

9 韓旭;;鞘內注射藥物治療手部腱鞘炎概述[J];中國民康醫(yī)學;2012年24期

10 張群強,彭孝廉;鞘內注射MTX過量一例臨床觀察[J];臨床內科雜志;1989年03期

相關會議論文 前5條

1 韓英;趙偉;袁云枝;;鏈霉素鞘內注射后發(fā)生可逆性截癱1例[A];2005年中國防癆協(xié)會全國學術會議論文集[C];2005年

2 崔陽;;鞘內注射藥物治療全身活動不明顯的神經(jīng)精神狼瘡[A];中華醫(yī)學會全國風濕病學年會論文匯編[C];2003年

3 傅志儉;張維;謝s，

本文編號：1723885