本文選題：肌萎縮側(cè)索硬化　切入點(diǎn)：腺相關(guān)病毒　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種中年起病的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,大部分患者在診斷后的3-5年內(nèi)死于呼吸衰竭。該病選擇性地?fù)p傷大腦皮層、腦干及脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,從而導(dǎo)致臨床表現(xiàn)為肌肉萎縮以及肌肉無力。盡管約90%為散發(fā)病例,銅/鋅超氧化物歧化酶1(Cu2+/Zn2+superoxide dismutase,SOD1)基因突變?nèi)允亲顬槭熘募易逍约∥s側(cè)索硬化的病因,并且攜帶人類突變的SOD1-G93A基因的小鼠已經(jīng)被普遍地應(yīng)用于肌萎縮側(cè)索硬化治療及病因探索上來。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)一直以來作為生理及病理情況下血管生成的重要因素而廣泛研究,近年來許多研究證實(shí)其對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存在確定的保護(hù)作用,其在ALS中的重要作用也引起了廣泛關(guān)注。許多不同的載體及給藥途徑被用于轉(zhuǎn)運(yùn)VEGF至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Azzouz等人應(yīng)用慢病毒作為載體通過肌肉注射的方式將VEGF轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元,并發(fā)現(xiàn)該方法可以有效地延長ALS鼠的生存期。也有研究通過側(cè)腦室注射(Intracerebroventricular,ICV)的方式將VEGF蛋白或者是以腺相關(guān)病毒血清4型(Adeno-associated virus 4,AAV4)為載體的VEGF基因轉(zhuǎn)運(yùn)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。另外也有研究通過鞘內(nèi)注射的方式將過表達(dá)VEGF的神經(jīng)干細(xì)胞移植至SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠。這些不同的給藥方式均可以延長ALS小鼠的生存期。然而,我們希望進(jìn)一步提高VEGF的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,尋找更有效的給藥途徑和方式。已有研究表明以巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)為啟動(dòng)子的AAV9載體于脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)最強(qiáng),而鞘內(nèi)注射雖然為有創(chuàng)操作,但是其具有用量小,脫靶效應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn),因此本研究中我們構(gòu)建以CMV為啟動(dòng)子的AAV9載體通過鞘內(nèi)注射的方式來轉(zhuǎn)運(yùn)VEGF,從而提高其轉(zhuǎn)染效率,進(jìn)而觀察VEGF對ALS小鼠生存期的影響。ALS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,許多復(fù)雜的分子及細(xì)胞水平機(jī)制都可以導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性。盡管多數(shù)研究都將關(guān)注點(diǎn)放在了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷,近年來許多研究發(fā)現(xiàn)非神經(jīng)元細(xì)胞也參與其發(fā)病機(jī)理并影響疾病的病情進(jìn)展。這種非細(xì)胞自身的毒性對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡至關(guān)重要。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的固有免疫細(xì)胞是加速疾病進(jìn)展的重要因素,并且在炎癥反應(yīng)過程中也發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)選擇性地抑制ALS小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中的重要的炎癥調(diào)控因子NF-k B可以明顯的減少運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡。而活化的小膠質(zhì)細(xì)胞又可以根據(jù)刺激因子及周圍環(huán)境的不同分為經(jīng)典活化型(M1型)與選擇活化型(M2)兩種分型。在疾病早期,起到神經(jīng)保護(hù)作用的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞為主,而隨著疾病進(jìn)展在疾病快速進(jìn)展期,由于許多細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1(Interleukin-1,IL-1)、γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)等的產(chǎn)生,小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸以促炎的M1型為主。因此,本研究在以往VEGF作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索其對ALS小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞增生及神經(jīng)炎癥的作用,以求進(jìn)一步了解VEGF對神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制。第一部分鞘內(nèi)注射scAAV9-VEGF-165對ALS小鼠生存期及行為學(xué)的影響目的:驗(yàn)證改良后的鞘內(nèi)注射方式是否可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效地表達(dá)目的基因;構(gòu)建以CMV為啟動(dòng)子的攜帶VEGF-165治療基因的scAAV9載體,并通過改良簡化的鞘內(nèi)注射方式干預(yù)90天的雌性及雄性ALS小鼠,觀察ALS小鼠生存期及行為學(xué)的改變。方法:1構(gòu)建以CMV為啟動(dòng)子的scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP病毒載體,經(jīng)純化透析后,通過PCR技術(shù)驗(yàn)證病毒滴度。2我們選取美國Jackson實(shí)驗(yàn)室的SOD1G93A小鼠為動(dòng)物模型,并在恒定溫度、恒定濕度且無特殊病原菌的動(dòng)物房中飼養(yǎng)、繁殖。改良的簡化鞘內(nèi)注射方式:小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后,用透氣紗布覆蓋小鼠頭部及軀干上部,并用拇指及食指固定小鼠髂骨部位,減去腰部毛發(fā)暴露中線位置。酒精消毒皮膚后,用漢密爾頓微量注射器在髂骨中線部位以70-80°進(jìn)針,感受到脊柱骨面后將進(jìn)針角度減少至30°并嘗試滑入椎間隙(L5-6)。小鼠出現(xiàn)側(cè)向甩尾或是尾巴呈現(xiàn)“S”形可以作為進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的標(biāo)記。3小鼠經(jīng)簡化的鞘內(nèi)注射方式給予scAAV9-GFP(1 x 109 vg/g)干預(yù)三周后,分別將小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材或直接新鮮取材,通過免疫熒光及蛋白印跡技術(shù)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)及分布特點(diǎn),驗(yàn)證改良的鞘內(nèi)注射方式是否可以有效的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)目的基因蛋白。4采用簡化的鞘內(nèi)注射方式分別干預(yù)90天雌性及雄性的ALS小鼠。將同窩的、體重相近的90天雌性及雄性的ALS小鼠隨機(jī)的分為兩組,通過簡化的鞘內(nèi)注射方式按體重分別給予scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP(1μl/g),每組各15只。觀察給藥組及對照組的生存期并記錄其體重,同時(shí)通過腳印分析、轉(zhuǎn)輪及神經(jīng)功能評分來評估ALS小鼠的運(yùn)動(dòng)功能,從而觀察VEGF對ALS小鼠的治療作用。結(jié)果:1構(gòu)建的scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP載體經(jīng)PCR檢測病毒滴度為1×1012 vg/ml;2鞘內(nèi)注射scAAV9-GFP三周后,免疫熒光結(jié)果顯示綠色熒光蛋白主要在脊髓前角表達(dá),并可以與Neu N標(biāo)記的神經(jīng)元共定位。免疫印跡結(jié)果表明,通過我們改良后的簡易的鞘內(nèi)注射方式給予scAAV9-GFP后,綠色熒光蛋白可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá),包括脊髓、小腦、皮層,并且以脊髓分布為主;3經(jīng)scAAV9-VEGF-165鞘內(nèi)注射干預(yù)的雌性ALS小鼠較對照組生存期延長13天(P㩳0.01),雄性小鼠生存期延長12天(P㩳0.01),雌性、雄性之間的天數(shù)區(qū)別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在早期,GFP對照組小鼠的體重相較于VEGF給藥組小鼠偏低,但是這種差別并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,直到121天(雌鼠)和129天(雄鼠)時(shí),GFP對照組小鼠的體重與VEGF-165給藥組小鼠的體重差異才存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腳印分析表明在小鼠110天時(shí),對照組表現(xiàn)出更明顯的步態(tài)異常以及步長變短的情況。在轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)中,VEGF-165給藥組雌、雄小鼠的表現(xiàn)均較對照組好。同時(shí),給予VEGF-165后可以延緩小鼠神經(jīng)功能評分的降低。另外,我們通過對小鼠腓腸肌的HE染色發(fā)現(xiàn),GFP對照組小鼠肌肉萎縮更加明顯,HE染色可見角型萎縮及核中心移位。第二部分鞘內(nèi)注射VEGF通過其抗凋亡作用保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元目的:觀察鞘內(nèi)注射scAAV9-VEGF-165后的ALS小鼠較對照組脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目及形態(tài)的變化,并對其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究。方法:1我們選取美國Jackson實(shí)驗(yàn)室的SOD1G93A小鼠為動(dòng)物模型,并在恒定溫度、恒定濕度且無特殊病原菌的動(dòng)物房中飼養(yǎng)、繁殖。隨機(jī)將6組90天ALS小鼠給予鞘內(nèi)注射scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP,3周后分別將小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材(3組)或直接新鮮取材(3組)。2通過免疫組化染色計(jì)數(shù)VEGF-165給藥組及GFP對照組SMI-32陽性細(xì)胞數(shù),并觀察VEGF-165給藥組及GFP對照組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)變化。3通過原位末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP end-labeling,TUNEL)檢測VEGF-165給藥組及GFP對照組小鼠腰髓細(xì)胞凋亡情況,并進(jìn)一步通過免疫印跡技術(shù)檢測VEGF-165給藥組及GFP對照組小鼠PI3K/Akt信號通路的改變及抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的水平變化。結(jié)果:1免疫組化結(jié)果顯示110天取材的VEGF-165治療組小鼠的腰髓SMI-32陽性細(xì)胞數(shù)較GFP對照組小鼠明顯保留(8.8±1.96個(gè)/層vs.6.2±1.3個(gè)/層,P㩳0.05),且運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)更加完整;2TUNEL檢測結(jié)果表明VEGF-165治療組小鼠腰髓TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少(24.8±8.2%vs.44.5±14.4%,P㩳0.05);3給予scAAV9-VEGF-165鞘內(nèi)注射3周后,小鼠腰髓VEGF-165水平明顯升高約2倍,通過免疫印跡技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)VEGF-165治療組小鼠脊髓PI3K/Akt信號通路激活,PI3K/Akt水平較對照組升高,且活化的caspase-9及caspase-3水平降低(P㩳0.05)。同時(shí),與GFP對照組相對比,VEGF-165治療組小鼠的脊髓中抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高而促凋亡蛋白Bax水平下降(P㩳0.05)。第三部分VEGF治療減少ALS小鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞增生并調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞分化目的:觀察鞘內(nèi)注射scAAV9-VEGF-165后的ALS小鼠較對照組脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)的變化,并探討VEGF對小膠質(zhì)細(xì)胞分型及神經(jīng)炎癥的影響。方法:1我們選取美國Jackson實(shí)驗(yàn)室的SOD1G93A小鼠為動(dòng)物模型,并在恒定溫度、恒定濕度且無特殊病原菌的動(dòng)物房中飼養(yǎng)、繁殖。隨機(jī)將6組90天ALS小鼠給予鞘內(nèi)注射scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP,3周后分別將小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材(3組)或直接新鮮取材(3組)。2通過免疫組化染色計(jì)數(shù)VEGF-165給藥組及GFP對照組GFAP及Iba1陽性細(xì)胞數(shù),并觀察VEGF-165給藥組及GFP對照組星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化,另外通過免疫印跡技術(shù)觀察VEGF治療組小鼠及對照組小鼠脊髓CD11b及GFAP水平的差異。3通過免疫熒光技術(shù)觀察VEGF治療組、GFP對照組ALS小鼠及陰性對照鼠脊髓CD68的表達(dá)及其與Iba1共定位的情況,另外通過PCR技術(shù)分析研究VEGF治療組、GFP對照組ALS小鼠及陰性對照鼠脊髓中CD68、TNF-α、IL-1β、Arginase-1以及Ym-1m RNA水平的差異,并通過免疫印跡技術(shù)觀察VEGF治療組、GFP對照組ALS小鼠及陰性對照鼠脊髓中CD68、TNF-α、Arginase-1及轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor beta,TGF-β)蛋白水平的差異。結(jié)果:1免疫組化結(jié)果顯示110天取材的GFP對照組小鼠的腰髓GFAP(311±46個(gè)/層vs.163±17.61個(gè)/層,P㩳0.05)及Iba1陽性細(xì)胞數(shù)(383±19.15個(gè)/層vs.218.3±28.02個(gè)/層,P㩳0.05)較VEGF治療組小鼠增生明顯,且膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)更為肥大。免疫印跡結(jié)果表明VEGF治療組小鼠較GFP對照組小鼠脊髓中CD11b及GFAP蛋白水平明顯降低(P㩳0.05),與免疫組化結(jié)果一致;2免疫熒光結(jié)果表明陰性小鼠脊髓CD68陽性細(xì)胞數(shù)很少,而GFP對照組ALS小鼠CD68陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,而給予VEGF治療后CD68陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少,同時(shí)CD68陽性細(xì)胞可以與Iba1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞共標(biāo)記;3PCR結(jié)果表明給予VEGF治療后的ALS小鼠脊髓中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(CD68、TNF-α、IL-1β)的水平較對照組降低(P㩳0.05),而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(Arginase-1及Ym-1)的水平有所升高(P㩳0.05);4免疫印跡結(jié)果顯示與PCR結(jié)果一致,即VEGF治療后可以提高ALS小鼠脊髓中Arginase-1的水平,并減少CD68、TNF-α蛋白的表達(dá),同時(shí)可以使TGF-β水平升高,而TGF-β可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型。結(jié)論:1本研究采用了改良后簡化的鞘內(nèi)注射手法干預(yù)小鼠,并構(gòu)建了以CMV為啟動(dòng)子的scAAV9病毒載體,通過該方法給予scAAV9-GFP后,發(fā)現(xiàn)目的蛋白可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá),并主要表達(dá)于脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,從而證實(shí)該方法的可操作性,為下一步進(jìn)行VEGF干預(yù)治療提供依據(jù)。2與以往研究結(jié)論一致,我們采用改良后的鞘內(nèi)注射方式給予ALS小鼠scAAV9-VEGF治療后,雌性及雄性小鼠生存期均較對照組延長,且運(yùn)動(dòng)功能明顯改善,進(jìn)一步肯定了VEGF對ALS的治療作用。3VEGF治療后ALS小鼠脊髓神經(jīng)元得以保留,我們進(jìn)一步證實(shí)了其神經(jīng)保護(hù)作用得益于PI3K/Akt信號通路的激活,促凋亡蛋白水平降低而抗凋亡蛋白水平升高。4小膠質(zhì)細(xì)胞增生在ALS發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,我們研究得出VEGF治療后可以有效減少ALS小鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞增生,并能調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞分型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R744.8

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本文編號：1723885