本文選題：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎　切入點(diǎn)：多發(fā)性硬化癥　出處：《陜西師范大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis, MS)是一種由1型輔助T細(xì)胞(Thl)和17型輔助T細(xì)胞(Thl7)介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性炎性脫髓鞘疾病。該病主要累及青壯年,是造成青壯年神經(jīng)系統(tǒng)功能性殘障的最主要因素之一。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是為了研究多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis, MS)而建立的動物模型,對該動物模型的研究表明,Thl細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子IFN-y通過作用于免疫細(xì)胞在EAE的疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,但是其如何作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system; CNS)的細(xì)胞,尤其是在體內(nèi)情況下其作用效果研究的較少。因此,本研究利用髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)免疫誘導(dǎo)的EAE動物模型,通過側(cè)腦室注射特異性敲低星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)或小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)IFN-γ受體(IFN-γR1)表達(dá)的方法阻斷不同CNS細(xì)胞IFN-y信號通路,研究CNS不同細(xì)胞特異性IFN-y信號通路在EAE中的作用及其作用機(jī)制,以期為更好的理解MS/EAE的病程機(jī)制并尋找新的細(xì)胞特異性靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。所取得的主要研究結(jié)果如下：1.利用免疫熒光雙染技術(shù)發(fā)現(xiàn),在小鼠脊髓切片中,IFN-γR1在星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá),神經(jīng)元中不表達(dá)IFN-yr1;2.利用免疫熒光染色及實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在MOG免疫誘導(dǎo)的EAE模型的脊髓和腦組織中,相較于健康小鼠,IFN-γR1呈誘導(dǎo)表達(dá),提示CNS的IFN-γ信號通路可能參與了EAE的病程發(fā)生;3.構(gòu)建基于miR-30的星型膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞／單核巨噬細(xì)胞特異性IFN-γR1敲低的慢病毒載體,體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,該慢病毒可以有效的敲低IFN-γR1的表達(dá)；4.EAE臨床神經(jīng)功能評分提示星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞特異性沉默IFN-γ信號通路在EAE誘導(dǎo)發(fā)病過程中具有截然相反的作用,星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性阻斷IFN-γ信號通路會減輕疾病的嚴(yán)重程度,然而,小膠質(zhì)細(xì)胞特異性阻斷該信號通路則會加重疾病病情；5.通過HE染色,脊髓單個核細(xì)胞計數(shù)以及流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn),星型膠質(zhì)細(xì)胞特異性阻斷IFN-γ信號通路減少了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性細(xì)胞浸潤,從而使得脫髓鞘程度減輕；6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞降低了脊髓中致炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-17A的表達(dá),同時,趨化因子CXCL2、CXCL12、CCL20和MMP9等的表達(dá)顯著降低。體外星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),敲低IFN-γR1之后,星型膠質(zhì)細(xì)胞在IL-17以及IL-17和TNF刺激下,相應(yīng)IL-17信號通路的趨化因子CXCL1和CXCL2以及CCL20的表達(dá)顯著降低,而在IFN-γ或IFN-γ和TNF的刺激下,相應(yīng)IFN-γ信號通路的化學(xué)趨化因子CXCL9、CXCL10以及CXCL11的表達(dá)顯著下降�；瘜W(xué)趨化實(shí)驗(yàn)證實(shí),IFN-γR1缺失的星形膠質(zhì)細(xì)胞招募或趨化單個核細(xì)胞的能力顯著下降；7.阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞的IFN-γ信號通路促進(jìn)了中樞的炎性浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。HE染色、脊髓單個核細(xì)胞計數(shù)以及流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性阻斷IFN-γ信號通路增加了腦干和脊髓的炎性細(xì)胞浸潤。實(shí)時熒光定量PCR顯示,小膠質(zhì)細(xì)胞特異性阻斷IFN-γ信號通路對CNS趨化因子表達(dá)的影響不明顯,IFN-γ的表達(dá)量顯著降低,而抗炎性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)量顯著降低。免疫熒光染色以及流式細(xì)胞分析顯示小膠質(zhì)細(xì)胞特異性阻斷IFN-γ信號顯著增加了CNS小膠質(zhì)細(xì)胞／單核巨噬細(xì)胞的數(shù)量。8.利用體外培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn),IFN-γ處理顯著降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量,而IFN-γ處理對IFN-γR1缺失的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量則沒有影響。實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IFN-γ能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞趨化因子以及致炎性細(xì)胞因子的表達(dá),但其更顯著的作用表現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞IFN-γ信號通路能顯著控制或抑制該類細(xì)胞的數(shù)量。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)相較于星形膠質(zhì)細(xì)胞,IFN-γ或IFN-γ結(jié)合TNF的處理可以顯著提高p21的表達(dá)并抑制cmyc的表達(dá),提示小膠質(zhì)細(xì)胞上的IFN-γ信號通路通過影響細(xì)胞周期來控制細(xì)胞的數(shù)量。同時caspase免疫熒光染色以及LDH活性測定表明IFN-γ信號通路影響小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量不是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡或壞死來實(shí)現(xiàn)的；9.在發(fā)病初期或發(fā)病高峰期特異性阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞IFN-γ信號通路可以有效緩解Thl細(xì)胞和Th17細(xì)胞介導(dǎo)的EAE疾病的嚴(yán)重程度。上述結(jié)果表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同細(xì)胞同一信號通路可能在疾病中起著不同的病理作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞的IFN-γ信號通路通過影響趨化因子的表達(dá)來影響疾病發(fā)展,而小膠質(zhì)細(xì)胞的該信號通路則通過影響控制小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量來影響疾病進(jìn)程。該研究結(jié)果對于進(jìn)一步理解MS/EAE的病程機(jī)制具有重要意義,也有利于發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞特異性的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:Multiple sclerosis (Multiple sclerosis MS) is a T cell by helper type 1 (Thl) and type 17 helper T cells (Thl7) mediated by the central nervous system autoimmune inflammatory demyelinating disease. The disease mainly affects young adults, is one of the main factors causing the young nervous system function of disability. The experimental autoimmune encephalomyelitis (Experimental autoimmune, encephalomyelitis, EAE) in order to study multiple sclerosis (Multiple sclerosis, MS) and the establishment of the animal model of the animal model, characteristic cell factor IFN-y Thl cells by acting on immune cells in EAE the disease plays an important role in the development, but its role in the central nervous system (central nervous system; CNS) cells, especially in the case of the in vivo effects of less. Therefore, this study uses the myelin sheath Oligodendrocyte glycoprotein (Myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG EAE) animal model of immune induced, knockdown of astrocytes by intracerebroventricular injection of specific (Astrocyte) or microglia (microglia) IFN- receptor gamma (IFN- gamma R1) expression of CNS cells with methods of blocking IFN-y signal pathway of different cell specific CNS IFN-y signal pathway in the role of EAE and its mechanism, in order to better understand the disease mechanism of MS/EAE and lay the foundation for cell specific new target. The main results are as follows: 1. using immunofluorescence double staining technique found in mouse spinal cord slices, IFN- gamma R1 in astrocytes cells, microglia and oligodendrocytes were expressed, the expression of IFN-yr1 in neurons; 2. by immunofluorescence staining and real-time fluorescence quantitative PCR technology found in EAE model induced by vaccination with MOG The type of spinal cord and brain tissue, compared with healthy mice, IFN- showed R1 expression induced by gamma gamma, suggesting that IFN- signaling pathway of CNS may be involved in the course of EAE; 3. building miR-30 astrocytes or microglia / macrophage specific IFN- gamma R1 lentiviral vector based on knock is low. In vivo and in vitro experiments, the expression of lentivirus can effectively knockdown of IFN- gamma R1; 4.EAE clinical neurological function score showed opposite effects on astrocytes or microglia specific silencing IFN- signal pathway in EAE induced pathogenesis, astrocyte specific blocking severity, IFN- gamma signal pathway will reduce the severity of the disease. However, microglia specific blocking this pathway will aggravate the disease; 5. by HE staining of spinal cord mononuclear cell counting and flow cytometry analysis showed that astrocytes fine Cell specific blocking IFN- signal pathway of gamma reduces CNS inflammatory cell infiltration, so as to reduce the degree of demyelination; 6. in vivo, blocking astrocytes reduced expression of inflammatory cytokines induced by IL-17A and IL-6 in the spinal cord at the same time, chemokine CXCL2, CXCL12, CCL20 and MMP9 expression etc. decreased significantly. Astrocytes cultured in vitro experiments showed that after knockdown of IFN- gamma R1, astrocytes in IL-17 and IL-17 and TNF under the stimulation of the corresponding signal pathway of IL-17 chemokine CXCL1 and CXCL2 and CCL20 expression decreased significantly, while IFN- or IFN- gamma gamma and TNF stimulation the corresponding chemical IFN- signal pathway of gamma chemokine CXCL9, CXCL10 and CXCL11 expression decreased significantly. Chemotactic experiments confirmed that IFN- gamma R1 deficient astrocytes recruitment or chemotaxis of mononuclear cells significantly decreased the ability of; 7. blocking IFN- signal pathway of gamma microglia promote inflammatory CNS infiltration and proliferation of microglial cells with.HE staining, spinal cord mononuclear cell counting and flow cytometry analysis showed that microglia specific blocking IFN- signal pathway of gamma increases the brainstem and spinal cord infiltration of inflammatory cells. Real time fluorescent quantitative PCR display microglia, the blocking effect of IFN- signal pathway on CNS expression of chemokines is not obvious, the expression of IFN- gamma was significantly decreased, whereas the expression of anti-inflammatory cytokines significantly decreased IL-10. Immunofluorescence staining and flow cytometry analysis showed that microglia specific blocking primary microglia IFN- the gamma signal significantly increased the number of.8. CNS microglia / macrophage in vitro showed that IFN- gamma treatment significantly reduced the number of microglia, and IFN- gamma gamma R1 treatment on IFN- It did not affect the number of microglia was found missing. Real time fluorescent quantitative PCR experiments, IFN- gamma can promote the expression of microglia chemokines and proinflammatory cytokines, but the more significant role can significantly control or suppression of these cells in microglia IFN- gamma pathway. Further the analysis found that compared to astrocytes, can significantly increase the expression of p21 and inhibiting the expression of cmyc IFN- or IFN- TNF combined with gamma gamma treatment, suggesting that IFN- number of gamma signal pathway of microglial cells by influencing the cell cycle to control cells. At the same time, caspase staining and LDH activity assay showed that the number of microglia IFN- gamma signaling influences by promoting apoptosis or necrosis is not achieved; 9. in early onset or the peak incidence of specific blocking astrocyte IFN- gamma signal The severity of the road can effectively alleviate the Thl cell and Th17 cell mediated EAE disease. The above results indicate that the central nervous system of different cells in the same signaling pathway may play a role in the pathology of different diseases. The expression of IFN- gamma signaling pathway in astrocytes by influencing the chemotactic factor to influence the development of the disease, and the number of the signal pathway of microglia is affected by control of microglia to influence the disease process. The research result has important significance to further understand the mechanism of the course of MS/EAE, but also conducive to find new therapeutic target cell specificity.

【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R744.51

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本文編號：1721982