本文選題：肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)　切入點：銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種由運動神經(jīng)元死亡引起的,成年發(fā)作的,致命的神經(jīng)退行性疾病。絕大多數(shù)ALS病例為發(fā)病原因不明的散發(fā)性ALS (sALS),其余約10%具有家族史,稱為家族性ALS(fALS)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種家族性ALS致病基因,SOD1(銅鋅超氧化物歧化酶)和FUS (fused in sarcoma)是其中的兩種。為了了解ALS的發(fā)生機制,并最終為ALS的治療提供新途徑,本實驗研究了SOD1的自噬降解途徑；鑒定了一種新型的FUS結(jié)合蛋白。 (1)ALS相關(guān)的SOD1突變體的自噬性降解 SOD1是最早發(fā)現(xiàn)的ALS致病基因,約占家族性ALS病例的20%。SOD1突變體對運動神經(jīng)元的損傷不是功能缺失而是獲得性毒性引起的。因此,了解SOD1突變體的降解清除途徑可以為ALS的發(fā)生及治療提供新的線索。通過比較野生型SOD1和ALS相關(guān)SOD1突變體(A4V, G93A)在細胞內(nèi)的表達,發(fā)現(xiàn)SOD1突變體的表達水平較野生型明顯下降,并且形成大的聚集體,表現(xiàn)出明顯的去垢劑不溶性。研究證明多種神經(jīng)退行性疾病致病蛋白通過自噬途徑降解。為了驗證ALS相關(guān)的SOD1突變體是否通過該途徑降解,利用多種自噬調(diào)節(jié)劑,如rapamycin抑制mTOR誘導(dǎo)自噬發(fā)生,Beclinl通過與PI3KⅢ (也稱為hVps34)結(jié)合增強其激酶活性誘導(dǎo)自噬起始,3-MA抑制PI3KⅢ活性從而抑制自噬小體的形成,Bafilomycin Al和NH4C1抑制自噬小體和溶酶體的融合,E64d和pepstatin A抑制溶酶體中組織蛋白酶活性等調(diào)控自噬過程,結(jié)果顯示誘導(dǎo)自噬可以促進SOD1的降解,而抑制自噬則導(dǎo)致SOD1發(fā)生堆積。此外,利用一種pH敏感的雙熒光標(biāo)簽發(fā)現(xiàn)SOD1突變體可以被包裹進自噬溶酶體中。因此,ALS相關(guān)SOD1突變體經(jīng)自噬途徑降解。 (2) SOD1G93A突變體對自噬活性的影響 作為機體在病理條件下清除異常蛋白的一種潛在機制,自噬可以被多種聚集體蛋白活化。通過檢測不同發(fā)病階段的ALS小鼠體內(nèi)的自噬小體標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ的表達水平,發(fā)現(xiàn)其在發(fā)病末期(125d)較對照組顯著升高。細胞模型中,利用Bafilomycin A1抑制自噬小體-溶酶體融合,發(fā)現(xiàn)SOD1G93A突變體可以提高內(nèi)源性LC3Ⅱ的水平,促進共轉(zhuǎn)染的EGFP-LC3Ⅰ向EGFP-LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化,提示在細胞模型中SOD1突變體可以誘導(dǎo)自噬小體的形成。為了探討其可能的機制,檢測了SOD1G93A對自噬起始關(guān)鍵因子Beclinl與其結(jié)合蛋白(ATG14L、Rubicon及UVRAG)結(jié)合能力的影響。結(jié)果顯示,與野生型對照組相比,SOD1G93A對ATG14L, Rubicon和UVRAG與Beclin1的結(jié)合能力無明顯影響,說明SOD1G93A可能通過其它途徑影響了自噬的發(fā)生。 (3) Gemin3作為ALS相關(guān)FUS蛋白的結(jié)合蛋白的鑒定 FUS是最近發(fā)現(xiàn)的一種新型ALS致病蛋白。作為一種RNA/DNA結(jié)合蛋白,FUS參與mRNA轉(zhuǎn)錄,剪接,運輸及成熟等過程。因此,FUS突變引起的RNA代謝異常可能在ALS的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用,但目前對其致病機制的了解還很有限。為了揭示FUS突變體可能的致病機制,利用質(zhì)譜蛋白組學(xué)的方法,發(fā)現(xiàn)了Gemin3(也稱為DP103或DDX20),一種SMN復(fù)合體組分,是FUS的結(jié)合蛋白。GST-pulldown和Co-IP實驗證實了野生型FUS和ALS相關(guān)的FUS突變體均可與Gemin3相互作用,且野生型與突變體之間沒有明顯差異。利用FUS和Gemin3的截斷突變體發(fā)現(xiàn)FUS結(jié)合于Gemin3的C末端(438-824氨基酸),Gemin3結(jié)合于FUS的QSYG區(qū)(1-165氨基酸)。細胞中過表達FUS突變體使Gemin3形成與FUS聚集體共定位的大的細胞質(zhì)斑點,抑制細胞核內(nèi)Gem小體的形成,并且引起Gemin3在去垢劑不溶部分發(fā)生堆積。此外,FUS突變體可以下調(diào)細胞內(nèi)U snRNP的水平,引起E1A報告基因的剪接異常。因此,結(jié)果表明FUS突變體可能通過將Gemin3包裹進聚集體中引起U snRNP功能缺陷,使隨后的rnRNA前體剪接發(fā)生改變。 總之,實驗結(jié)果表明ALS相關(guān)的SOD1通過自噬途徑降解,為開發(fā)自噬調(diào)控因子以清除體內(nèi)的SOD1突變體作為ALS治療的手段提供了依據(jù)；鑒定了FUS與Gemin3之間的相互作用,為FUS相關(guān)的ALS的發(fā)生的研究提供了線索。
[Abstract]:Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is caused by a motor neuron death, adult onset, fatal neurodegenerative diseases. Most of the ALS cases for the unknown etiology of sporadic ALS (sALS), the remaining 10% with a family history, called familial ALS (fALS) has. Found a variety of familial ALS disease gene, SOD1 (superoxide dismutase) and FUS (fused in sarcoma) is one of the two. In order to understand the mechanism of ALS, and provides a new way for the treatment of ALS, the experimental study on the autophagy of SOD1; identification of a novel the FUS binding protein.
(1) autophagic degradation of ALS associated SOD1 mutants
SOD1 is the earliest discovered ALS gene, about 20%.SOD1 mutant familial ALS cases of motor neuron injury but not loss of function caused by acquired toxicity. Therefore, understanding the degradation of mutant SOD1 pathways may provide new clues for the pathogenesis and therapy of ALS. Through the comparison of wild type SOD1 and ALS SOD1 mutants (A4V, G93A) expression in cells and found that the expression level of SOD1 mutants compared to the wild type was significantly decreased, and the formation of large aggregates, showed obvious detergent insoluble. Studies show that a variety of neurodegenerative disease proteins through the autophagy pathway degradation. In order to verify whether the SOD1 mutant ALS by the degradation, using a variety of autophagy regulators, such as rapamycin inhibited mTOR induced autophagy by Beclinl and PI3K III (also known as hVps34) with the kinase activity induced by self enhancement The initial formation of 3-MA macrophages, inhibiting the activity of PI3K III inhibits autophagosome fusion, Bafilomycin Al and NH4C1 inhibited the autophagosome and lysosome, E64d and pepstatin A in inhibition of cathepsin activity of lysosomal regulation of the autophagic process, the result indicated that the degradation induced autophagy can promote SOD1, and inhibition of autophagy leads to the occurrence of SOD1 accumulation. In addition, the use of double a pH sensitive fluorescence label SOD1 mutant can be wrapped into autophagolysosomes. Therefore, ALS related SOD1 mutant by autophagy pathway degradation.
(2) effect of SOD1G93A mutant on autophagy activity
As a potential mechanism for the body to eliminate abnormal protein in pathological conditions, autophagy can be activated by protein aggregates. The expression level of autophagosome marker LC3 in ALS mice at different stages of the detection of the disease, the end (125d) was significantly higher than the control group. The cell model, using Bafilomycin A1 inhibition of autophagy lysosomefusion, SOD1G93A mutant can increase endogenous LC3 II level, promote the transformation of EGFP-LC3 co transfected to EGFP-LC3 I II, suggesting that the formation of the cell model in SOD1 mutants can induce autophagic bodies. In order to explore the possible mechanism of SOD1G93A detection of autophagy initiation key transcription factor Beclinl binding protein (ATG14L Rubicon, and UVRAG) affect the binding capacity. The results showed that, compared with the wild type control group, SOD1G93A of ATG14L, Rubicon and UVRAG and Beclin1 Binding ability had no significant effect, indicating that SOD1G93A may influence through other ways of autophagy.
(3) identified as a ALS binding protein related protein FUS Gemin3
FUS is a new type of ALS pathogenic protein discovered recently. As a RNA/DNA binding protein, FUS participates in mRNA transcription, splicing, transport and maturation process. Therefore, the mutation of FUS RNA caused by abnormal metabolism may play a key role in the process of ALS, but its pathogenesis remains unclear in order to reveal the pathogenic mechanism of FUS mutants may, by using the method of mass spectrometry proteomics, found Gemin3 (also known as DP103 or DDX20), a component of SMN complex, FUS binding protein.GST-pulldown and Co-IP experiments showed that the wild type FUS and ALS related FUS mutants can interact with Gemin3, no obvious the difference between wild type and mutant. And the use of truncated mutants FUS and Gemin3 found C terminal FUS binding to Gemin3 (438-824 amino acids), Gemin3 binding to FUS QSYG (1-165 amino acids) in cells overexpressing FUS mutation. To the formation of Gemin3 co localized with FUS aggregates of cytoplasmic spots, inhibit the formation of nuclei of Gem bodies, and caused Gemin3 insoluble part accumulation in detergent. In addition, the FUS mutant can lower intracellular U levels of snRNP, E1A by reporter gene splicing. Therefore, the results show that the FUS mutant may pass the Gemin3 packages in U snRNP aggregates caused by defects, the subsequent pre rnRNA splicing change.
In conclusion, the experimental results show that ALS related SOD1 degradation by autophagy pathway, and provide a basis for the development of autophagy regulation factor to clear the SOD1 mutant in vivo as ALS treatment; the interaction between FUS and Gemin3 were identified, study the occurrence of FUS related ALS provided clues.

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R744.8

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本文編號：1719262