本文選題：紅景天苷　切入點：神經(jīng)保護(hù)　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,可以反復(fù)發(fā)作,有很高的發(fā)病率和致死率。在世界范圍內(nèi),有1%的人口受到癲癇的困擾,我國也有近1000萬癲癇患者,其中20%的患者會進(jìn)展為難治性癲癇。癲癇長期反復(fù)發(fā)作可以引起認(rèn)知功能障礙,嚴(yán)重影響患者的生活,給家庭和社會造成很大負(fù)擔(dān)。目前,臨床上應(yīng)用抗癲癇藥物(Antiepileptic drugs,AEDs)來控制癲癇發(fā)作,但是AEDs藥物對三分之一的患者無效,甚至還會引起注意力下降、認(rèn)知功能障礙等副作用。因此,急需尋找一種既能控制癲癇反復(fù)發(fā)作,又能改善患者認(rèn)知功能障礙的藥物。海人藻酸(Kainic acid,KA)是一種谷氨酸的同系物,可以激活谷氨酸受體,引起神經(jīng)元損傷。高劑量的KA單次給藥可以誘導(dǎo)實驗動物的癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epileptics,SE)發(fā)作,而SE會誘發(fā)自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作(Spontaneous recurrent seizures,SRS),這一過程類似于人類癲癇的發(fā)病過程,因此,該模型作為經(jīng)典的癲癇在體動物模型被廣泛應(yīng)用于癲癇的研究。在海馬神經(jīng)元中,無Mg2+細(xì)胞外液可以誘導(dǎo)神經(jīng)元穩(wěn)定持久放電,而神經(jīng)元反復(fù)異常的放電可以造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變,引起突觸重構(gòu),最終形成異常的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò),該細(xì)胞模型模擬了人類癲癇發(fā)作時神經(jīng)元異常放電的過程,是比較成熟的癲癇離體模型。癲癇的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明,但一些重要的發(fā)病環(huán)節(jié)已為人類所知。目前,有幾種學(xué)說受到研究者們的關(guān)注,包括離子通道、谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒、神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等。氧化應(yīng)激可以引起活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生過多,造成機(jī)體內(nèi)源性的自由基和抗氧化酶失衡,引起細(xì)胞損傷。過多的ROS可以氧化DNA,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá),誘發(fā)神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致癲癇發(fā)作。因此,抗氧化劑在治療癲癇方面有重要作用。紅景天是生長于高海拔地區(qū)的植物,在我國主要分布于西藏。紅景天苷(Salidroside,SDS)是從紅景天的根莖中提取的主要活性成分。SDS有多種生物學(xué)活性,包括耐受缺氧、抗衰老、抑制腫瘤生長、消除炎癥、緩解疲勞以及心血管保護(hù)效應(yīng)。近些年發(fā)現(xiàn),sds可以迅速通過血腦屏障(bloodbrainbarrier,bbb),對腦缺血、血管性癡呆、阿爾茲海默病(alzheimer’sdisease,ad)有治療作用。此外,sds還可以改善低氧引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷,減輕腦缺血、ad、衰老誘發(fā)的認(rèn)知功能障礙。然而,sds在癲癇中的作用尚未見相關(guān)報道。因此,本研究利用ka建立的小鼠se模型,從在體水平觀察了sds對癲癇引起腦損傷的保護(hù)效應(yīng);利用無mg2+細(xì)胞外液誘導(dǎo)的癲癇細(xì)胞模型,從離體水平探討了sds發(fā)揮保護(hù)作用可能的分子機(jī)制。本研究由以下三部分組成。第一部分紅景天苷對海人藻酸誘導(dǎo)的小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的保護(hù)作用目的:建立ka誘導(dǎo)的小鼠se模型,觀察sds預(yù)處理對癲癇發(fā)作、腦電圖以及氧化應(yīng)激損傷的作用。方法:將雄性8-10周的c57bl/6小鼠隨機(jī)分為6組,對照組35只,其余各組56只。對照組(con):腹腔給予0.9%無菌生理鹽水;ka組:ka溶于0.9%無菌生理鹽水,腹腔給予30mg/kg的ka;sds25mg/kg+ka組:sds溶于0.9%無菌生理鹽水,在注射ka前1h給予25mg/kgsds;sds50mg/kg+ka:在注射ka前1h給予50mg/kgsds;vehicle+ka組:在注射ka前1h給予0.9%無菌生理鹽水;50mg/kgsds組:在0.9%無菌生理鹽水注射前1h給予50mg/kgsds。在注射ka后2h,觀察各組小鼠se潛伏期、se發(fā)生率以及腦電圖改變,依據(jù)racine行為分級法,小鼠癲癇發(fā)作達(dá)到4級,持續(xù)時間至少30min認(rèn)為是達(dá)到se。此外,在注射ka后15min、45min、3h、6h、12h、24h和48h分別取小鼠海馬組織檢測丙二醛(malondialdehyde,mda)含量、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)活性、還原型谷胱甘肽(reducedglutathione,gsh)含量。結(jié)果:1在注射ka后2h,有90%的小鼠存活,有80%的小鼠成功誘發(fā)se。與ka組小鼠相比,sds預(yù)處理可以延長se發(fā)作的潛伏期(p0.05),減少se的發(fā)病率(p0.05),增加小鼠的存活率,并且高濃度的sds(50mg/kg)比低濃度的sds(25mg/kg)有更明顯的保護(hù)效應(yīng)(p0.05)。con組和sds組小鼠均無癲癇發(fā)作,vehicle+ka組和ka組相比,小鼠se發(fā)作程度和潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。2mda含量:與con組相比,小鼠海馬組織mda含量在注射ka后15min開始增加,在45min達(dá)到峰值,之后隨著時間推移,mda含量有所下降,但仍高于相同時間點的con組(p0.05);sds預(yù)處理可以明顯減少ka組小鼠海馬中mda含量(p0.05),并且sds50mg/kg組中mda含量低于sds25mg/kg組(p0.05);與ka組相比,vehicle+ka組小鼠海馬組織中mda含量無明顯改變(p0.05)。3sod活性:給予ka后15min,小鼠海馬組織的sod活性開始下降,在45min時達(dá)到最低值(p0.05),之后有所增加,但仍低于相同時間點con組小鼠的sod活性(p0.05)。與ka組相比,sds預(yù)處理可以增加sod活性(p0.05),并且50mg/kg濃度的sds組使其增加更明顯(p0.05);與ka組相比,vehicle+ka組小鼠海馬組織中sod活性無明顯變化(p0.05)。4gsh含量:不同實驗組中小鼠海馬組織gsh的改變趨勢與sod相似,ka可以減少gsh含量,并且在45min時減少最明顯(p0.05),而sds預(yù)處理可以增加gsh含量(p0.05),并且50mg/kg濃度的sds使其增加更明顯(p0.05);vehicle+ka組小鼠海馬組織中g(shù)sh的含量與ka組相比則無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。第二部分紅景天苷對海人藻酸致癇小鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用目的:利用ka建立小鼠se模型,觀察sds對srs發(fā)作、認(rèn)知功能障礙和海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。方法:本研究中共56只小鼠,其中10只小鼠作為對照組(con)每天腹腔注射0.9%無菌生理鹽水,剩余46只小鼠腹腔給予30mg/kg的ka誘導(dǎo)se發(fā)作。依據(jù)racine行為分級法,小鼠癲癇發(fā)作達(dá)到4級,持續(xù)時間至少30min認(rèn)為是達(dá)到se,成功誘導(dǎo)的se小鼠納入后續(xù)實驗。46只小鼠在注射ka后2h,41只存活,其中36只小鼠達(dá)到se發(fā)作,將其隨機(jī)分為4組,每組9只。ka組:ka溶于0.9%無菌生理鹽水,腹腔給予30mg/kg的ka;ka+sds5mg/kg組:sds溶于0.9%無菌生理鹽水,在注射ka后第二天開始每天腹腔給予5mg/kgsds,連續(xù)給藥14天;ka+sds10mg/kg組:從注射ka后第二天開始每天腹腔給予10mg/kgsds,連續(xù)給藥14天;ka+vehicle組:從注射ka后第二天開始每天腹腔給予0.9%生理鹽水,連續(xù)給藥14天。同時,用v-eeg連續(xù)記錄小鼠srs發(fā)作情況。14天后用morris水迷宮檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力;用nissl染色觀察海馬ca1、ca3區(qū)存活神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)目。結(jié)果:1con組小鼠無癲癇發(fā)作;46只小鼠注射ka后,存活率為89.13%,se發(fā)生率為78.26%。v-eeg結(jié)果顯示,與ka組相比,ka+sds5mg/kg組和ka+sds10mg/kg組中srs每次發(fā)作持續(xù)時間明顯縮短(p0.05),并且高濃度sds組中srs發(fā)作時間更短(p0.05)。ka+sds5mg/kg組和ka+sds10mg/kg組srs發(fā)作嚴(yán)重程度、發(fā)作頻率均較ka組明顯降低(p0.05)。ka+vehicle組和ka組相比,srs發(fā)作持續(xù)時間、嚴(yán)重程度和頻率均無顯著差異(p0.05)。2morris水迷宮:在定位航行實驗中,隨著訓(xùn)練時間增加,各組小鼠的逃逸潛伏期均縮短。從訓(xùn)練第二天開始,不同實驗組小鼠的逃逸潛伏期出現(xiàn)差異:與con組相比,ka組小鼠逃逸潛伏期明顯延長(p0.05);ka+sds5mg/kg組和ka+sds10mg/kg組小鼠逃逸潛伏期較ka組明顯縮短(p0.05)�？臻g探索實驗中,小鼠穿越平臺次數(shù)有顯著差異:與con組相比,ka組小鼠穿越平臺的次數(shù)減少(p0.05);sds治療組較ka組次數(shù)增多(p0.05),并且ka+sds10mg/kg組多于ka+sds5mg/kg組(p0.05)。ka組小鼠在目標(biāo)象限逗留的時間比con組明顯縮短(p0.05),ka+sds5mg/kg、ka+sds10mg/kg組小鼠在目標(biāo)象限逗留的時間較ka組明顯延長(p0.05)。ka+vehicle組與ka組相比,小鼠的逃逸潛伏期、穿越平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限逗留的時間均無差異(p0.05)�？梢娖脚_實驗中,不同實驗組小鼠的游泳速度、逃逸潛伏期均無顯著差別。3nissl染色:在con組中,小鼠海馬ca1、ca3區(qū)神經(jīng)元無明顯丟失、結(jié)構(gòu)完整、胞漿內(nèi)nissl小體豐富;在ka組中,神經(jīng)元出現(xiàn)明顯丟失、細(xì)胞核固縮,nissl小體數(shù)量較con組減少;ka+sds5mg/kg和ka+sds10mg/kg組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對完整,nissl小體數(shù)量較ka組增加。ka組小鼠海馬ca1區(qū)和ca3區(qū)的神經(jīng)元存活數(shù)量均較con組明顯減少(p0.05);與ka組相比,ka+sds5mg/kg組和ka+sds10mg/kg組神經(jīng)元數(shù)量顯著增加(p0.05),并且ka+sds10mg/kg組ca1、ca3神經(jīng)元數(shù)量均高于ka+sds5mg/kg組(p0.05);ka+vehicle組海馬神經(jīng)元存活數(shù)量與ka組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。第三部分紅景天苷在癲癇細(xì)胞模型中的保護(hù)作用及其分子機(jī)制目的:應(yīng)用無mg2+細(xì)胞外液孵育小鼠海馬神經(jīng)元建立細(xì)胞癲癇模型,觀察sds對癲癇細(xì)胞損傷的影響及其可能的作用機(jī)制方法:利用出生24h內(nèi)的小鼠分離出海馬神經(jīng)元,接種到培養(yǎng)基中,培養(yǎng)到第7天,將細(xì)胞隨機(jī)分為8組:正常對照組(con):含有1mmol/lmg2+的細(xì)胞外液,作用神經(jīng)元3h后,更換為正常培養(yǎng)基;細(xì)胞模型組(model):不含mg2+的細(xì)胞外液,作用3h后,更換為正常培養(yǎng)基;sds30μmol/l組:不含mg2+的細(xì)胞外液,作用3h后,加入含有sds濃度為30μmol/l的培養(yǎng)基作用2h,更換為正常培養(yǎng)基;sds60μmol/l組:不含mg2+的細(xì)胞外液,作用3h后,加入60μmol/lsds作用2h后,更換為正常培養(yǎng)基;sds120μmol/l組:不含mg2+的細(xì)胞外液孵育3h后,加入120μmol/lsds作用2h,更換為正常培養(yǎng)基;compoundc組:不含mg2+的細(xì)胞外液孵育3h后,加入120μmol/lsds作用2h,再加入50μmol/lcompoundc作用1h,更換為正常培養(yǎng)基;sirtinol組:不含mg2+的細(xì)胞外液孵育3h后,加入120μmol/lsds作用2h,再加入100μmol/lsirinol作用1h,更換為正常培養(yǎng)基;vehicle組:不含mg2+的細(xì)胞外液孵育3h后,加入和120μmol/lsds相同體積的0.9%無菌生理鹽水作用2h,更換為正常培養(yǎng)基。在各種藥物作用結(jié)束后24h,采用cck-8檢測細(xì)胞活力,ldh檢測細(xì)胞損傷程度,calcein-am/pi進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù),流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,real-timepcr檢測ampk、sirt1的mrna水平,westernblot檢測ampk、sirt1的蛋白表達(dá),sirt1去乙�；富钚苑治鰴z測sirt1去乙酰化酶活性。結(jié)果:1cck-8檢測:與con組相比,癲癇細(xì)胞活力明顯下降(p0.05);建立癲癇細(xì)胞模型后,給予30μmol/l、60μmol/l、120μmol/l三個劑量的sds,60μmol/lsds組和120μmol/lsds組細(xì)胞活力較癲癇細(xì)胞組增加,并且120μmol/lsds組增加更明顯(p0.05);vehicle組和癲癇細(xì)胞組相比細(xì)胞活力無明顯改變(p0.05)。2ldh檢測:癲癇細(xì)胞ldh釋放量較con組明顯增加(p0.05),sds可以抑制ldh的釋放,并且呈現(xiàn)劑量依賴性,120μmol/l濃度的sds對ldh的釋放有更明顯的抑制作用(p0.05);與癲癇細(xì)胞組相比,vehicle組細(xì)胞ldh活性無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。3calcein-am/pi雙染:癲癇模型組細(xì)胞存活率較con組明顯減少(p0.05);與癲癇模型組相比,sds使細(xì)胞存活率顯著增加(p0.05);vehicle組和模型組相比,細(xì)胞存活率無明顯差異(p0.05)。4細(xì)胞凋亡檢測:與con組相比,癲癇細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.05),SDS可以減少癲癇組細(xì)胞的凋亡率(P0.05);Compound C是AMPK(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制劑,Sirtinol為SIRT1(Silent information regulator 1,SIRT1)酶活性抑制劑,Compound C和Sirtinol可以抑制SDS對癲癇細(xì)胞凋亡的影響;Vehicle組和模型組相比,細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5Real-Time PCR:與Con組相比,癲癇組細(xì)胞中AMPK的mRNA水平下調(diào)(P0.05);SDS組與癲癇細(xì)胞組相比,AMPK的mRNA水平上調(diào)(P0.05);Vehicle組和模型組AMPK的mRNA水平無差異。SIRT1的mRNA水平在各組間無明顯改變。6 Western blot:與Con組相比,癲癇模型組細(xì)胞AMPK的蛋白表達(dá)明顯減少(P0.05);SDS可以使模型組AMPK的表達(dá)增加(P0.05);Vehicle和模型組相比,AMPK的蛋白表達(dá)無明顯差異(P0.05)。SIRT1的蛋白表達(dá)在各組間無明顯改變。7 SIRT1去乙�；富钚�:癲癇細(xì)胞組SIRT1去乙�；富钚暂^Con組降低(P0.05);與模型組相比,SDS組SIRT1活性增加(P0.05);Compound C組SIRT1酶活性較SDS組明顯降低(P0.05);Vehicle組與模型組相比,SIRT1酶活性無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1在KA誘導(dǎo)的小鼠SE模型中,SDS預(yù)處理可能通過改善氧化應(yīng)激損傷而起到抑制SE發(fā)作的作用,并且在注射KA后45 min有最顯著作用。2在KA誘導(dǎo)的小鼠SE模型中,SRS引起小鼠認(rèn)知功能障礙和海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元損傷;SDS后處理可以抑制SRS發(fā)作,并且可能通過減輕神經(jīng)元損傷而改善小鼠的認(rèn)知功能。3在應(yīng)用無Mg2+細(xì)胞外液孵育小鼠海馬神經(jīng)元建立的細(xì)胞癲癇模型中,SDS可能通過激活A(yù)MPK/SIRT1信號通路抑制細(xì)胞凋亡,從而減輕癲癇引起的神經(jīng)元損傷。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1710258