本文選題：帕金森病　切入點：肌細胞增強因子MEF2D　出處：《第四軍醫(yī)大學》2014年碩士論文

【摘要】：背景及目的： 帕金森病是一種嚴重影響運動功能的神經(jīng)退行性疾病[1]。該病在65歲以上老年人中的發(fā)病率大概在1-2%，影響著全世界數(shù)百萬老齡人群的生活和健康。帕金森病的臨床癥狀主要是靜止性震顫，肌張力增高和運動遲緩，還伴有植物神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀和情緒情感的變化。嚴重者生活不能自理，為家庭和社會增添了沉重的經(jīng)濟負擔和精神心理負擔。目前的治療手段主要在于改善臨床癥狀，，但是都無法改變該病的進行性進展的步伐。弄清帕金森病的病因以及探索其背后的發(fā)病機制對于家庭和社會來說具有重大意義。帕金森病的病因目前仍然不是十分清楚，研究顯示，衰老與帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)。帕金森病的主要病理特點是多巴胺能神經(jīng)元的死亡。研究顯示，一些神經(jīng)毒素能夠特異性的損傷黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元。比如，MPTP，6-OHDA，魚藤酮和百草枯等[2,3,4,5,6]。針對神經(jīng)毒素導致帕金森病的分子機制，人們進行了大量的研究工作。有研究證實，自噬和帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)。帕金森病相關(guān)的毒劑能夠影響自噬的過程。例如，MPTP，作為線粒體復合物Ⅰ的抑制劑，可以抑制自噬[7]。6-OHDA能夠上調(diào)黑質(zhì)神經(jīng)元中的LC-3,從而促進大自噬[4,8]。百草枯可以使自噬囊泡在胞內(nèi)堆積[9,10]。所以這些神經(jīng)毒素常用于帕金森病細胞和動物模型的建立。 肌細胞增強因子MEF2D是一種轉(zhuǎn)錄因子，是自噬的底物之一。有研究證實，MEF2D是神經(jīng)元存活的重要調(diào)節(jié)因子，和帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)[11,12]。MEF2D作為轉(zhuǎn)錄因子，可以參與細胞核和線粒體的基因轉(zhuǎn)錄表達，若MEF2D的水平下降，則導致神經(jīng)元死亡，所以MEF2D在多巴胺能神經(jīng)元的存活中起著關(guān)鍵性的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)毒素應激可通過磷酸化修飾MEF2D加速其降解[13,14]。但是，前人的研究主要集中在神經(jīng)毒素對MEF2D的翻譯后修飾水平的研究。是否存在神經(jīng)毒素對MEF2D其他調(diào)節(jié)途徑目前尚無報道。神經(jīng)毒素能否通過影響MEF2D mRNA的水平而影響其蛋白的表達水平呢？因此，我們進行了本實驗，以探究神經(jīng)毒素對MEF2DmRNA表達水平的影響，并進一步探究神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA穩(wěn)定性的影響和MEF2D mRNA的變化對細胞存活死亡的作用。 方法： 本實驗首先在多巴胺能神經(jīng)元細胞系SN4741細胞中，采用神經(jīng)毒素MPP+處理，通過實時定量PCR技術(shù)檢測不同時間點的MEF2D mRNA的變化。然后利用體內(nèi)帕金森病模型進一步驗證細胞學實驗結(jié)果。在C57小鼠中，腹腔注射神經(jīng)毒素MPTP造成小鼠亞急性帕金森病模型，通過激光捕獲顯微切割的方法選擇性的切取酪氨酸羥化酶（TH）陽性的神經(jīng)元，然后通過實時定量PCR技術(shù)特異性地檢測多巴胺能神經(jīng)元中MEF2D mRNA的變化。進一步，通過放線菌素D抑制基因轉(zhuǎn)錄實驗，探索神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA穩(wěn)定性的影響。隨后，通過慢病毒感染的方法將細胞中的MEF2D mRNA降低，通過流式細胞儀檢測和蛋白電泳觀察MEF2D mRNA的降低對神經(jīng)元存活死亡的作用。 結(jié)果： 實驗一：帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA水平的影響 （1）在SN4741細胞中，加入50uM的神經(jīng)毒素MPP+后12小時，24小時和36小時分別收集細胞檢測，免疫細胞熒光和蛋白電泳結(jié)果顯示，和對照組相比，MPP+組的MEF2D蛋白水平下降。然后，提取分離細胞中的mRNA，實時定量PCR結(jié)果顯示，和對照組相比，MPP+組的MEF2D mRNA水平也下降，和蛋白水平的下降趨勢相一致。 （2）C57小鼠腹腔注射MPTP構(gòu)建帕金森病亞急性模型。第一次腹腔注射MPTP后3天和5天處死小鼠，取腦切片染色進行相關(guān)實驗。免疫組織熒光染色結(jié)果顯示，和對照組相比，TH陽性的神經(jīng)元的數(shù)目明顯下降，表明小鼠亞急性帕金森模型構(gòu)建成功。采用快速染色和激光捕獲顯微切割特異性地切取TH陽性的神經(jīng)元后，提取RNA，實時定量PCR的結(jié)果顯示，和對照組相比，MPTP組的MEF2D mRNA顯著下降(Р0.01)。 實驗二：帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素對MEF2D mRNA穩(wěn)定性的影響以及MEF2DmRNA水平的變化對神經(jīng)元存活的作用 （1）放線菌素D能夠快速有效的抑制基因轉(zhuǎn)錄，常用于mRNA半衰期的檢測。通過放線菌素D抑制基因轉(zhuǎn)錄實驗，我們發(fā)現(xiàn)，放線菌素D單獨處理組的MEF2DmRNA半衰期為1.5小時，而同放線菌素D和MPP+聯(lián)合處理組的MEF2D mRNA半衰期為0.6小時，兩組之間有顯著差異，Р0.01。表明MPP+影響了MEF2D mRNA的穩(wěn)定性。 （2）慢病毒shRNA-MEF2D感染后，通過半定量PCR證實了慢病毒的干擾效果。隨后，通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，對照組的凋亡細胞比例為0.4%，空病毒載體FUGW組的凋亡細胞比例為0.5%，而shRNA-MEF2D組的凋亡細胞比例為14%。這說明，單獨干擾MEF2D mRNA水平就能夠誘導細胞凋亡。 （3）在神經(jīng)毒素MPP+處理條件下，活化的caspase3的水平顯示，和正常對照組和FUGW組相比，shRNA-MEF2D組的活化的caspase3的量明顯增高。這說明，降低MEF2D mRNA能夠使細胞對MPP+的毒性更加敏感。 結(jié)論： 本實驗主要的創(chuàng)新點在于發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)毒素調(diào)控MEF2D的新途徑，即在轉(zhuǎn)錄水平上對MEF2D進行調(diào)控。另外，運用了當今先進的激光捕獲顯微切割技術(shù)，能夠特異性地獲取目的細胞，排除了周圍細胞的干擾，確保了實驗結(jié)果的準確性。 （1）在SN4741細胞系和C57小鼠帕金森病模型中，帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素能夠使MEF2D mRNA降低。MEF2D mRNA的降低是和其蛋白水平的降低相一致的。 （2）帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素通過影響MEF2D mRNA的穩(wěn)定性，導致MEF2DmRNA降低。 （3）單獨降低MEF2D mRNA，能夠誘導多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。 （4）降低MEF2D mRNA能夠加重帕金森病相關(guān)的神經(jīng)毒素誘導的多巴胺能神經(jīng)元的死亡。
[Abstract]:Background and Purpose :

Parkinson ' s disease is a neurodegenerative disease that severely affects exercise . The morbidity of Parkinson ' s disease is about 1 - 2 % , affecting the lives and health of millions of elderly people all over the world . The clinical symptoms of Parkinson ' s disease are mainly characterized by static tremor , increased muscle tone and slow motion .

It is found that MEF2D is an important regulatory factor for neuronal survival and is closely related to the pathogenesis of Parkinson ' s disease .

Method :

In this experiment , the changes of MEF2D mRNA in dopaminergic neurons were detected by means of real - time quantitative PCR . The effect of neurotoxin on MEF2D mRNA stability was investigated by means of laser capture microdissection .

Results :

The Effect of Neurotoxin Associated with Parkinson ' s Disease on MEF2D mRNA Level

( 1 ) In SN4741 cells , the levels of MEF2D protein in MPP + group decreased after adding 50uM neurotoxin MPP + 12 hours , 24 hours and 36 hours respectively .

( 2 ) The subacute model of Parkinson ' s disease was constructed by intraperitoneal injection of MPTP in C57 mice . The mice were sacrificed 3 days and 5 days after the first intraperitoneal injection of MPTP . The results showed that the number of TH - positive neurons decreased significantly after the first intraperitoneal injection of MPTP . The results showed that the expression of MEF2D mRNA in MPTP group was significantly decreased compared with the control group ( P0.01 ) .

The effects of neurotoxins associated with Parkinson ' s disease on the stability of MEF2D mRNA and the effect of the changes of MEF2DmRNA level on the survival of neurons

( 1 ) actinomycin D can effectively inhibit the transcription of mRNA and is often used for the detection of mRNA half - life . Through actinomycin D , we find that the half - life of MEF2 DmRNA of actinomycin D alone is 1.5 hours , while the half - life of MEF2D mRNA in actinomycin D and MPP + combined treatment group is 0.6 hours , and there is a significant difference between the two groups .

( 2 ) After the slow virus shRNA - MEF2D infection , the interference effect of the lentivirus was confirmed by semi - quantitative PCR . The percentage of apoptotic cells in the control group was 0.4 % and 0.5 % in the control group , while the percentage of apoptotic cells in the shRNA - MEF2D group was 14 % .

( 3 ) Under the condition of MPP + treatment , the level of activated caspase3 showed that the amount of caspase - e3 activated in shRNA - MEF2D group was significantly higher than that of normal control group and FUGW group .

Conclusion :

The main innovation point of this experiment is to find a new way to regulate MEF2D by neurotoxin , that is to regulate the MEF2D at the transcriptional level . In addition , the advanced laser capture microdissection technique is used to obtain the target cell specifically , the interference of peripheral cells is eliminated , and the accuracy of the experimental results is ensured .

( 1 ) In the SN4741 cell line and the Parkinson ' s disease model of C57 mice , the neurotoxins associated with Parkinson ' s disease were able to lower the MEF2D mRNA . The decrease in MEF2D mRNA was consistent with the reduction of its protein level .

( 2 ) Neurotoxin associated with Parkinson ' s disease , by affecting the stability of MEF2D mRNA , resulted in a decrease in MEF2DmRNA .

( 3 ) MEF2D mRNA alone can induce apoptosis of dopaminergic neurons .

( 4 ) The decrease of MEF2D mRNA can aggravate the death of dopaminergic neurons induced by neurotoxins associated with Parkinson ' s disease .

【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

【共引文獻】

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本文編號：1707936