本文選題：PEBP4　切入點：膠質(zhì)瘤　出處：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有原位腫瘤中最常見的腫瘤,膠質(zhì)瘤大概占顱內(nèi)惡性腫瘤的50%左右。美國每年有超過14000位新患者被診斷出腦膠質(zhì)瘤,其每年的全國發(fā)病率為0.005%。其中膠質(zhì)母細胞瘤患者占總數(shù)的60-70%,間變性星形細胞瘤占10-15%,間變性少突膠質(zhì)細胞瘤和間變性少突星形細胞瘤大約占10%,其余為罕見的腫瘤如間變性室管膜瘤和間變性神經(jīng)節(jié)細胞膠質(zhì)瘤。因為大部分膠質(zhì)瘤為浸潤性、彌漫性生長,與周邊正常腦組織邊界不清而且容易復(fù)發(fā),故患者治愈率低、預(yù)后欠佳、總體生存期較短。盡管采取了最佳的治療方案包括手術(shù)切除輔以放療和(或)化療等綜合性治療,膠質(zhì)母細胞瘤患者的中位生存期僅僅為12.15個月,間變性膠質(zhì)瘤患者則為2-5年。在膠質(zhì)瘤臨床化學藥物治療中,相當數(shù)量的膠質(zhì)瘤對化療產(chǎn)生耐藥性是后期治療效果欠佳的主要原因,現(xiàn)在一線臨床化療藥物的實際有效率僅僅維持在20-30%左右。所以,有效解決化療藥物的耐藥性成為提高膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存率的重要途徑。因此,研究膠質(zhì)瘤中調(diào)節(jié)細胞耐藥行為的相關(guān)基因有助于我們進一步了解耐藥的分子機制,同時可以指導臨床制定膠質(zhì)瘤患者的個性化化療方案并判斷預(yù)后,這還為將來膠質(zhì)瘤的分子生物學治療提供相對理想的靶標基因。作為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族的新成員,PEBP4在人體各組織中都有一定的表達,它參與質(zhì)膜生物合成、神經(jīng)元發(fā)育、精子的形成、細胞凋亡等生理及病理生理過程,是一類體內(nèi)普遍存在的多功能復(fù)合型蛋白。近期相關(guān)研究表明PEBP4在腫瘤細胞中多方面的起著抗凋亡的生理病理作用,使其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有癌基因的功能同時發(fā)揮促癌作用。在腫瘤細胞中高表達的PEBP4可以抑制TNF-a(腫瘤壞死因子-α)或者TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體)誘導的細胞凋亡,包括抑制凋亡相關(guān)蛋白p53, p21CIP/WAF和BAX(Bcl2-相關(guān)X蛋白)的表達,同時提高凋亡抑制蛋白Bcl2和Bcl-XL的表達。另外,PEBP4不僅參與MAPK信號通路的抑制,而且抑制JNK信號通路同時激活A(yù)KT通路,從而影響腫瘤細胞的細胞周期和凋亡。由此可見PEBP4是腫瘤細胞中調(diào)節(jié)多條信號通路的關(guān)鍵因子,而這些上游的信號通路恰好能調(diào)控腫瘤細胞的生長、分裂及凋亡,所以更深入地研究PEBP4將有助于進一步了解腫瘤細胞的復(fù)雜生物學機制。本實驗擬在探討PEBP4在腦膠質(zhì)瘤中的具體生物學功能,我們首先明確PEBP4在不同級別的膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的基因和蛋白表達情況,并分析其表達與相關(guān)臨床資料特別是患者預(yù)后的相關(guān)性。其次,利用小片段RNA干擾和慢病毒載體干擾技術(shù),構(gòu)建PEBP4不同表達水平的細胞株,同時觀察其對膠質(zhì)瘤細胞株增殖、侵襲及細胞周期等惡性生物學的影響。隨后,檢測PEBP4干擾后膠質(zhì)瘤細胞株增殖、侵襲、細胞周期及凋亡相關(guān)蛋白的表達情況,明確PEBP4分子與ERK1/2信號通路可能存在的相互關(guān)系。最后,我們將PEBP4干擾后的細胞株與替莫唑胺進行共同培養(yǎng),觀察PEBP4表達對膠質(zhì)瘤細胞化療敏感性的影響。本次實驗共分三部分：第一部分,PEBP4在不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達水平以及其與患者預(yù)后的相關(guān)性；第二部分,通過PEBP4慢病毒干擾載體感染膠質(zhì)瘤細胞株,觀察PEBP4表達變化對膠質(zhì)瘤細胞株增殖、侵襲和細胞周期的影響,同時利用shRNA干擾細胞PEBP4的表達,研究ERK1/2通路對膠質(zhì)瘤增殖、侵襲及凋亡的影響；第三部分,觀察不同表達水平的PEBP4對膠質(zhì)瘤細胞株替莫唑胺敏感性的影響及可能的機制,探討shRNA-PEBP4聯(lián)合替莫唑胺作用對細胞株克隆能力影響。第一部分PEBP4在膠質(zhì)瘤臨床組織標本中的表達研究目的：研究PEBP4在不同級別膠質(zhì)瘤臨床組織標本中的mRNA和蛋白表達水平,探討PEBP4表達與臨床病理因素的關(guān)系以及對患者預(yù)后的影響。方法：應(yīng)用免疫組織化學及Western blot檢測PEBP4在58例不同級別膠質(zhì)瘤組織的蛋白表達水平,同時運用Real-time PCR檢測PEBP4的mRNA表達水平。通過統(tǒng)計學方法驗證其與臨床病理因素之間的關(guān)系以及對膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響。結(jié)果：腫瘤組織中PEBP4的mRNA表達可能與膠質(zhì)瘤級別呈正相關(guān)(p0.05),同時PEBP4的蛋白表達相對于正常腦組織有明顯增高,這與mRNA的表達情況是一致的,而且PEBP4的蛋白表達隨著膠質(zhì)瘤級別的變高而顯著增強(p0.05)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)PEBP4主要在細胞質(zhì)及細胞膜中表達,在胞漿中呈彌漫性分布,棕色或棕黃色顆粒主要集中在細胞膜。臨床研究發(fā)現(xiàn),PEBP4表達與患者年齡、性別、KPS評分均無統(tǒng)計學意義,但是與膠質(zhì)瘤WHO分級關(guān)系密切(p=0.023)。單因素和多因素Cox回歸顯示,膠質(zhì)瘤患者的生存時間與WHO分級(p=0.013)和PEBP4表達(p=0.006)明顯相關(guān)。進一步的多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),在所有的臨床病理因素和生化參數(shù)中,PEBP4表達是判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后的唯一獨立因素。并且PEBP4的高表達提示膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后。結(jié)論：隨著膠質(zhì)瘤病理級別的增高,PEBP4的基因和蛋白表達同時隨之上調(diào)。同時相對于其它臨床因素,它是影響患者預(yù)后的獨立干預(yù)因素,并且PEBP4的高表達提示膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后。第二部分PEBP4在膠質(zhì)瘤細胞中的功能及分子機制研究目的：利用慢病毒載體抑制膠質(zhì)瘤細胞U251和U373中PEBP4的表達,探討PEBP4變化對膠質(zhì)瘤細胞株U251和U373增殖、侵襲和凋亡的影響。同時觀察shRNA干擾PEBP4表達后的膠質(zhì)瘤細胞株中U251和U373細胞周期、增殖、侵襲及凋亡的相關(guān)重要因子表達。并且進一步研究細胞株U251中PEBP4表達下調(diào)后,ERK1/2信號通路相關(guān)蛋白的變化。方法：運用PEBP4慢病毒干擾載體感染U251、U373細胞株,構(gòu)建PEBP4低表達的膠質(zhì)瘤細胞系。MTT法測定細胞增殖能力,Transwell試驗檢測侵襲水平,流式細胞儀測定細胞周期改變。Western blot測定腫瘤細胞增殖、侵襲及凋亡相關(guān)蛋白p-Rb、Cyclin D1、E-cadherin、Bcl-2及caspase-3的變化,同時測定ERK1/2信號通路的變化。進一步實驗中使用ERK1/2信號通路的特異性抑制劑U0126處理感染后的細胞株U251,利用Western blot檢測ERK1/2以及相關(guān)蛋白的變化,再次運用MTT檢測各組腫瘤細胞的增殖改變。結(jié)果：shRNA-PEBP4干擾載體構(gòu)建結(jié)果滿意,慢病毒包裝成功,感染U251和U373細胞后可顯著下調(diào)PEBP4的表達。MTT檢測結(jié)果說明,干擾PEBP4表達后膠質(zhì)瘤細胞U251和U373的增殖能力明顯減弱(p0.05)；侵襲性試驗表明PEBP4表達下調(diào)后腫瘤細胞的侵襲能力則顯著降低(p0.01)；細胞周期檢測發(fā)現(xiàn)PEBP4干擾病毒載體轉(zhuǎn)染U251和U373后,細胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯,S期和G2/M期縮短(p0.05)。進一步Western blot結(jié)果證實,PEBP4干擾后的U251和U373細胞中,p-Rb和細胞周期相關(guān)因子Cyclin D1表達下調(diào),而侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin上調(diào),促凋亡因子caspase-3表達增加,抗凋亡因子Bcl-2表達則減少,同時ERK1/2磷酸化水平升高,而總ERKl/2則沒有影響。使用特異性抑制劑U0126干擾ERK1/2通路后,Western blot結(jié)果顯示caspase-3表達上調(diào),Bcl-2表達則降低,表達趨勢與PEBP4干擾后的檢測結(jié)果相似,然而PEBP4的蛋白表達則無明顯變化。最后在shRNA-PEBP4處理后的U251細胞株中加入ERK1/2抑制劑U0126,結(jié)果顯示shR-PEBP4+NC組相對shR-ctrl+U0126組,腫瘤細胞的增殖能力明顯下降,這提示了ERK1/2可能是PEBP4的下游效應(yīng)分子。結(jié)論：PEBP4可能是通過調(diào)控ERKl/2信號通路,間接影響腫瘤細胞的周期進程,從而導致膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲及凋亡能力的改變。第三部分PEBP4表達對膠質(zhì)瘤細胞替莫唑胺敏感性的影響目的：探討PEBP4干擾對膠質(zhì)瘤細胞系U251MG和U373MG對化療藥物替莫唑胺(TMZ)敏感性的影響。方法：使用PEBP4慢病毒干擾載體感染U251、U373細胞株,建立PEBP4不同表達水平的U251、U373細胞系。此細胞系與不同濃度替莫唑胺共培養(yǎng)三天,MTT法測定第三天的細胞抑制率并計算各個IC50值。軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗檢測替莫唑胺對U251、U251-shRNA、U251-GFP及U373、U373-shRNA、U373-GFP克隆形成能力的影響。通過Western blot檢測U251、U373細胞中PEBP4干擾后多藥耐藥蛋白(P-gp,MRP1)及DNA損傷修復(fù)酶(MGMT, MMR)的變化。結(jié)果：利用3天MTT法測腫瘤細胞生長抑制率并計算IC50,結(jié)果在U251和U373細胞株中單獨使用TMZ的耐藥指數(shù)分別為23.26±2.44ug/mL和21.65±2.01ug/mL,同時U251和U373的空載體組與TMZ聯(lián)合作用的耐藥指數(shù)分別為21.33±1.27ug/mL和22.78±1.88ug/mL,然而干擾PEBP4表達組與TMZ聯(lián)合后U251和U373細胞對TMZ的耐藥指數(shù)分別為9.78±1.03ug/mL和8.06±1.82ugmL,相當于前二組指數(shù)明顯下降(p0.05)。在替莫唑胺濃度分別為0、0.05、0.10、0.15μmol/L時培養(yǎng)72h,U251-shRNA細胞組的克隆存活率分別為0.745±0.09、0.34±0.08、0.09±0.01、0.015±0.001, U373-shRNA細胞組的克隆存活率分別為0.713±0.16、0.29±0.07、0.06±0.01、0.01±0.001,結(jié)果表明,在TMZ濃度相同的情況下,二組細胞系中PEBP4干擾組的克隆存活率均顯著低于對照組及空白組(p0.05)。抑制PEBP4表達后,U251及U373細胞株中P-gp和MRP1的蛋白表達均無變化,而MGMT和MMR的蛋白表達均顯著下降。結(jié)論：PEBP4表達下調(diào)后可以增加膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的藥物敏感性,shRNA-PEBP4聯(lián)合替莫唑胺可以明顯降低腫瘤細胞的克隆能力,這可能是因為通過影響膠質(zhì)瘤細胞DNA損傷修復(fù)酶及凋亡的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1699027