本文選題：miR-182　切入點：膠質瘤　出處：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：第一部分血清microRNA-182在膠質瘤患者中的表達及其臨床應用價值研究研究背景膠質瘤是人類最常見的顱內惡性腫瘤之一,約占中樞神經系統(tǒng)腫瘤的60%,是腫瘤治療領域五大難以治愈的腫瘤之一。因其具有難治性、易局部播散和易復發(fā)等特點,導致預后不佳。近年來出現了包括手術治療、放療、化療及生物免疫治療在內的綜合治療模式,但膠質瘤的治療效果依然很差,5年生存率僅為約5%。導致預后差的主要原因之一為早期診斷困難,膠質瘤在被確診時往往已經對周圍腦組織產生了浸潤轉移。膠質瘤診斷的“金標準”仍然是組織學病理活檢,然而由于它的發(fā)生多處于位置深在的顱內重要部位,病理活檢手術創(chuàng)傷較大,患者及家屬常難以接受,導致早期獲取有效的病理學標本存在很大障礙。因此尋找一種新的、具有較高敏感度和特異度的生物標志物對其進行早期診斷就變得尤為重要。microRNAs (miRNAs)是一類非編碼小分子RNA,通過對其靶mRNA的調控發(fā)揮作用。越來越多的研究表明miRNAs在細胞的增殖、分化、凋亡及腫瘤的發(fā)生等多種生物學行為中具有重要作用。研究顯示miRNAs在多種惡性腫瘤中異常表達,且根據腫瘤類型的不同,其表達譜也不同。研究還發(fā)現miRNAs可以作為多種癌癥的一種早期診斷和預后評估的生物標志物。最近研究者也在開始研究異常表達的miRNAs用于膠質瘤早期診斷和預后評估的可行性,如microRNA-205, microRNA-128和microRNA-210,然而其敏感性和特異性均難滿足臨床需要。microRNA-182 (miR-182)具有高度的進化保守性,位于人類的第7號染色體上(7q32.2),其過度表達已被證實可促進腫瘤的生長、浸潤或影響這些腫瘤的化療敏感性。研究發(fā)現膠質瘤腫瘤組織中miR-182表達明顯上調,與不良預后和治療效果不佳密切相關。這也提示miR-182可能成為膠質瘤早期診斷和預后評估的一個潛在的生物標志物。而相對于腫瘤組織,血清是一個更加容易獲取的檢測樣本,對患者創(chuàng)傷更小,更易被患者接受。目前已經證實miR-182可在多種惡性腫瘤患者的血清中被穩(wěn)定的檢測到,然而miR-182在膠質瘤患者血清中的表達情況及其與臨床病理特點的關系尚不清楚。本課題組在結合國內外研究的基礎上,通過實時定量PCR (qRT-PCR)方法檢測血清miR-182在膠質瘤患者中表達情況,并結合患者的性別、年齡、腫瘤的大小、KPS評分和WHO病理分級、短期總生存率和無病生存率等多項臨床數據和特征,對其在膠質瘤臨床早期診斷和預后評估中的價值進行評估。研究目的1.檢測miR-182在膠質瘤患者血清中的表達水平。2.分析血清miR-182表達水平與膠質瘤患者臨床特征之間的關系。3.評估血清miR-182表達水平在膠質瘤患者早期診斷中的價值。4.研究血清miR-182表達水平對膠質瘤患者預后評估的意義。研究方法1. qRT-PCR方法檢測112例惡性膠質瘤患者與54例健康對照者的血清miR-182表達水平。比較膠質瘤患者與健康對照者及不同病理級別膠質瘤患者之間的血清miR-182表達水平差異。2.評估血清miR-182表達水平與膠質瘤患者各項臨床特點的相關性,主要包括：性別、年齡、腫瘤的大小、KPS評分和WHO病理分級。3.分析不同組別的膠質瘤患者血清miR-182表達水平的差異。ROC曲線下面積(AUC)及ROC曲線評估血清miR-182的早期診斷價值。4.隨訪全部患者,分析血清miR-182表達水平與膠質瘤患者的總生存率的無病生存期(DFS)和總生存期(OS)的關聯性。采用Kaplan-Meier分析評估血清miR-182對膠質瘤患者預后的預測價值。隨后運用單變量和多變量Cox回歸分析法以確定血清miR-182表達水平是否是膠質瘤患者預后的獨立因素,探討血清miR-182表達水平對膠質瘤患者預后評估的價值。研究結果1.miR-182在膠質瘤患者血清中的表達水平分析結果表明血清miR-182表達水平在膠質瘤患者組(mean±SD,2.57±1.95)明顯高于健康對照組(0.97±0.38)(P0.001)。在WHO Ⅳ級的膠質瘤患者血清中,miR-182表達水平明顯高于WHO Ⅰ級(P0.001)、WHO Ⅱ級(P0.001)和WHOⅢ級(P0.05)的患者。同時WHO Ⅳ級的膠質瘤患者血清miR-182表達水平明顯高于WHO Ⅰ級(P0.05)的膠質瘤患者。2.血清miR-182表達水平與膠質瘤患者臨床特點的相關性血清miR-182表達水平與膠質瘤患者KPS評分(P=0.025)和WHO病理分級((r=0.786,P=0.006)密切相關。而與膠質瘤患者性別、年齡、腫瘤的大小無統(tǒng)計學相關性(均P0.05)。3.血清miR-182表達水平對膠質瘤患者的早期診斷價值研究結果發(fā)現高級別膠質瘤患者組血清miR-182表達水平(3.25±2.05)明顯高于低級別膠質瘤患者組(1.38±0.94)和健康對照組(0.97±0.38)(均P0.001),但在低級別膠質瘤患者組和健康對照組之間無顯著性差異;P0.05)。 ROC曲線顯示AUC為0.778(95%CI,0.679-0.878),臨界值為1.56,相應的敏感度和特異度分別為58.5%和85.2%。血清miR-182水平對高級別膠質瘤的早期診斷價值分析,AUC為0.815(95%CI,0.718-0.913)。對低級別膠質瘤的早期診斷性能分析,AUC為0.621(95%CI,0.500-0.741),顯著低于全部的膠質瘤或高級別膠質瘤(均P0.05)。4.血清miR-182表達水平與腦膠質瘤患者預后評估的相關性分析血清miR-182高水平表達組的累計5年總生存率的無病生存期(DFS)和總生存期(OS)較血清miR-182低水平表達組短,其中高水平表達患者組DFS (32.786,95%CI:22.941-33.059)與低水平表達患者組DFS (44.923,95%CI: 31.487-58.513)比較有顯著差異(P=0.006)；高水平表達患者組OS (19.325, 95%CI:9.620-20.380)與低水平表達患者OS (30.638,95%CI:24.668-39.332)比較有顯著差異(P=0.003)。單變量Cox比例風險回歸模型分析顯示,DFS和KPS評分顯著相關(P0.001),同時也與患者的WHO病理分級(P0.001)和血清miR-182表達水平(P=0.009)顯著相關。同時結果顯示OS也和KPS評分(P0.001)、WHO病理分級(P0.001)以及血清miR-182表達水平(P=0.004)顯著相關。多變量Cox回歸分析表明血清miR-182表達水平為DFS (P=0.034)和OS(P=0.013)的獨立預后因素,而KPS評分及WHO病理分級也均為DFS和OS的獨立預后因素。結論1.血清miR-182表達水平在膠質瘤患者中明顯升高,且與腦膠質瘤患者WHO病理分級密切相關。2.血清miR-182對膠質瘤有一定的早期診斷價值,有可能成為一種潛在的腫瘤標志物。3.血清miR-182表達水平和膠質瘤患者預后顯著相關,對患者預后評估有一定作用。意義本課題明確了膠質瘤患者血清miR-182表達水平與及其與病理分級的關系,并提示血清miR-182水平對膠質瘤早期診斷和預后分析有一定意義。第二部分microRNA-182對膠質瘤細胞增殖的影響及作用機制研究研究背景膠質瘤是最常見的神經系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤之一,目前仍無有效的治愈手段。近年來雖多采用手術切除加輔助放化療的綜合治療模式,但患者預后依然不佳,生存期一般約為14個月。導致膠質瘤預后不佳的根本原因在于它的一系列惡性生物學行為,包括腫瘤細胞的過度增殖、對周圍腦組織的侵襲、化療藥物耐藥等,尤其是腫瘤細胞的過度增殖,是導致術后快速復發(fā)的重要因素。如何有效抑制膠質瘤細胞的過度增殖,從而延長患者的生存期并改善其生存質量,是目前膠質瘤治療領域的一大難題。對膠質瘤細胞過度增殖的分子作用機制進行研究,并針對其進行有效的干擾和抑制,以期能夠尋找一種膠質瘤治療的新靶點。近年來研究發(fā)現miRNAs可參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡的各個過程,通過結合目標mRNA的3’UTR區(qū)來調控目標基因的表達發(fā)揮作用。目前已經證實多種miRNAs與膠質瘤細胞的增殖、遷徙、凋亡和侵襲密切相關。如miR-663可以通過調節(jié)其目的靶基因TGF-β1來抑制膠質瘤細胞的增殖、遷徙和侵襲,miR-506的異常表達可調節(jié)其靶基因IGF2BP1來抑制膠質瘤細胞的增殖等等。miR-182是一種重要的miRNAs分子,在腫瘤細胞中過度表達,并促使細胞快速生長和增殖,這提示對miR-182的分子生物學作用機制進行研究可能有助于提高腫瘤的診療效果。研究表明卵巢癌時miR-182表達上調,調控其下游靶基因可促進腫瘤細胞的增殖。本課題第一部分研究已證實miR-182在膠質瘤患者血清中高表達,和患者的WHO病理分級等多種臨床特征密切相關,然而miR-182在膠質瘤細胞中的表達情況及對增殖的影響及其作用機制尚不清楚。基于國內外研究進展和前期研究的結果,本課題組擬分析miR-182在膠質瘤細胞系中的表達情況及對細胞增殖作用的影響。尋找并驗證miR-182下游靶基因,并分析它們在膠質瘤細胞增殖作用的分子生物學機制,以期為膠質瘤的治療提供一種新的靶點。研究目的1.檢測miR-182在U251、U118和LN319人膠質瘤細胞系和正常星形細胞中的表達情況。2.分別干擾和過表達miR-182,分析miR-182對增殖作用的影響。3.尋找并驗證miR-182下游目標靶基因,研究抑制和過表達miR-182后對下游目標靶基因和蛋白表達水平的影響。4.分別干擾和過表達miR-182下游靶基因,研究其對人膠質瘤細胞系增殖作用的影響。5.分別干擾和過表達miR-182及下游靶基因,探討miR-182-下游靶基因在膠質瘤細胞增殖中的作用機制。研究方法1. qRT-PCR檢測miR-182在3種膠質瘤細胞系和正常星型細胞中的表達培養(yǎng)膠質瘤細胞系U251、U118、LN319和正常星型細胞,qRT-PCR方法檢測miR-182在U251、U118、LN319膠質瘤細胞系和星型細胞中的表達情況。2.觀察miR-182對膠質瘤細胞的增殖能力的影響采用脂質體Lipofectamine 2000瞬時轉染方法按要求對U251膠質瘤細胞進行轉染,分別干擾和過表達miR-182。 qRT-PCR方法檢測轉染效率。WST-1方法在第24小時、48小時、72小時和96小時對細胞的增殖能力進行檢測。3.尋找并驗證miR-182在膠質瘤細胞中的下游目標靶基因,研究干擾和過表達miR-182對靶基因轉錄水平及靶蛋白表達水平的影響運用microRNAs和miRBase等生物信息學數據庫搜索miR-182的潛在目標靶基因,應用熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行驗證。運用qRT-PCR和Western blot方法分別檢測miR-182對靶基因轉錄及蛋白表達水平的影響。4.分別干擾和過表達靶基因,研究其對人膠質瘤細胞增殖作用的影響分別干擾和過表達靶基因。運用qRT-PCR和Western blot驗證干擾效率及過表達效率。WST-1方法對細胞進行增殖能力檢測。5.探討miR-182通過調控FOXO3在調節(jié)膠質瘤細胞增殖中的作用機制。分別干擾和過表達miR-182、干擾和過表達FOXO3,瞬時轉染后48小時采用WST-1方法檢測增殖能力,探討miR-182及其下游靶基因FOXO3在膠質瘤細胞的增殖活動中的分子作用機制。研究結果1.miR-182在膠質瘤細胞系和正常星形細胞中的表達結果顯示miR-182在膠質瘤細胞中的表達水平分別為LN319(0.1±0.05)、 U118(0.08±0.03)、U251 (0.24±0.05),明顯高于正常星形細胞NHA(0.06±0.01)(均P0.01)。三種細胞系的表達情況也有所差別,選擇表達最高的U251細胞進行下一步實驗。2.miR-182對膠質瘤細胞的增殖的影響分別將miR-182的mimics及inhibitor轉染到膠質瘤細胞系U251中：與對照組比較,siRNA-miR-182表達明顯下調(P=0.015),而miR-182 mimics表達明顯上調(P0.001)。培養(yǎng)48小時后,與空白對照組相比,miR-182 mimics組可明顯促進膠質瘤細胞增殖(P0.01),siRNA-miR-182組膠質瘤細胞增殖能力明顯減緩(P0.01)。選擇細胞培養(yǎng)48小時時進行下一步實驗。3.尋找并驗證miR-182目標靶基因應用miRBase等數據庫搜索到miR-182的潛在目標靶基因之一為FOXO3,且靶基因FOX03的3'-UTR區(qū)存在兩個高度保守的堿基序列,能與miR-182特異性結合。利用熒光素酶分析實驗對miR-182靶基因進行了鑒定,結果顯miR-182mimics與WT FOXO33'-UTR共轉染組的細胞熒光素酶活性明顯低于其他轉染組(P0.01),提示FOXO3是其調控的重要下游靶基因之一。轉染miR-182 mimics48h后,FOX03 mRNA(44.4%±6.96%,P=0.004)和蛋白(38.3%±.5.94%,P=0.006)水平下調。SiRNA-miR-182上調FOXO3 mRNA(2.08±0.41倍,P=0.002)和蛋白表達(2.09±0.38倍,P=0.004)。4. FOXO3對人膠質瘤細胞U251的增殖作用。qRT-PCR和Western blot驗證FOXO3干擾效率及過表達效率滿意。研究結果顯示干擾FOXO3表達可上調膠質瘤細胞的增殖(1.40±0.04倍,P=0.006),而過表達FOXO3則可降低膠質瘤細胞的增殖(23.8%±2.44%,P=0.005)。5.miR-182通過調控靶基因FOXO3參與膠質瘤細胞的增殖作用調節(jié)分別干擾和過表達miR-182及其下游靶基因FOXO3,研究結果顯示：過表達miR-182誘導的膠質瘤細胞增殖可被過表達FOXO3拮抗(P0.001),而過表達miR-182與siRNA-FOXO3聯合作用,則細胞增值上調作用更顯著(P=0.018)。干擾miR-182后抑制膠質瘤細胞增殖作用可被siRNA-FOXO3拮抗(P=0.008),而干擾miR-182與過表達FOXO3聯合作用對下調細胞增殖的作用更顯著(P=0.006)。結論1.miR-182在人膠質瘤細胞系中高表達,可顯著上調膠質瘤細胞的增殖。2. FOX03是miR-182的目標靶基因之一,參與調節(jié)膠質瘤細胞的增殖。3.miR-182通過調控FOX03來促進膠質瘤細胞的增殖。意義本課題明確了miR-182調控其下游目標靶基因FOXO3在膠質瘤細胞增殖過程中發(fā)揮作用的機制。而對miR-182進行干擾或過表達其靶基因FOXO3可能為膠質瘤提供新的治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1686741