本文選題：帕金森病　切入點：6-羥基多巴胺　出處：《蘇州大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導PC12細胞凋亡及其可能機制目的采用6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導PC12細胞損傷建立帕金森病的體外模型,探討GSK3β在6-OHDA誘導的凋亡途徑中的具體作用及6-OHDA對PC12凋亡的可能作用機制。方法采用6-羥基多巴胺誘導PC12細胞損傷建立帕金森病的體外模型,通過MTT檢測以及臺盼藍染料排除試驗檢測不同濃度的6-OHDA處理后的PC12細胞活性和生存率。利用免疫印跡法測定:1、總GSK3β和p-GSK3β水平;2、Bax和β-肌動蛋白水平,β-肌動蛋白用作細胞質(zhì)內(nèi)蛋白的內(nèi)參對照;3、Bax和prohibition蛋白水平,prohibition蛋白用作線粒體內(nèi)蛋白的內(nèi)參對照。結(jié)果1、6-OHDA刺激24后呈劑量依賴性(10、20、50、100、200μm)地抑制PC12細胞的細胞活性及細胞存活率。6-OHDA在100μM時顯著抑制PC12的活性和存活率。2、Western blot檢測結(jié)果顯示,6-OHDA處理呈時間依賴性地減少了GSK3β磷酸化。通過提取細胞線粒體和細胞質(zhì)來檢查Bax在細胞線粒體中存在的情況,結(jié)果顯示6-OHDA處理后細胞質(zhì)中Bax含量減少了,線粒體中Bax含量增加了,提示6-OHDA誘發(fā)了Bax的線粒體轉(zhuǎn)位。結(jié)論6-OHDA顯著降低了PC12細胞的活性,促進了PC12細胞凋亡,GSK3β在6-OHDA誘導的凋亡中起到一定作用,6-OHDA處理呈時間依賴性地減少GSK3β磷酸化,誘發(fā)了Bax的線粒體轉(zhuǎn)位,Bax可從細胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體中,引起線粒體功能障礙,進而導致細胞凋亡。第二部分促紅細胞生成素(EPO)對6-羥基多巴胺誘導PC12細胞凋亡的保護作用及其機制目的通過研究促紅細胞生成素對6-OHDA處理的PC12細胞的糖原合成酶激酶3β的磷酸化、Bax的線粒體轉(zhuǎn)位、Bcl-2表達水平、半胱天冬酶3活性,探討促紅細胞生成素(EPO)抑制6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導的凋亡的機制。方法PC12細胞用TDZD-8(25μM)或用不同濃度的EPO(0-10U/m L)預處理,隨后用100μM 6-OHDA孵育。采用MTT檢測和臺盼藍排除試驗測定不同處理后的細胞活性;免疫印跡法觀察GSK3β磷酸化水平、總GSK3β水平、Bax在細胞內(nèi)分布情況、抗增殖蛋白水平、Bcl-2以及β-肌動蛋白水平;Hoechst 33258染色法來估算凋亡PC12細胞的比例,使用半胱天冬酶3比色測定試劑盒系統(tǒng)估算半胱天冬酶3活性。結(jié)果1、EPO呈濃度依賴性地(濃度從1至10U/m L不等)降低6-OHDA誘導的生長抑制,GSK3β抑制劑4-苯基-2-甲基-1,2,4-噻二唑—3,5-二酮(TDZD8)顯著逆轉(zhuǎn)6-OHDA誘導的生長抑制。2、EPO和TDZD-8顯著逆轉(zhuǎn)6-OHDA對GSK3β磷酸化的抑制,也顯著抑制6-OHDA誘導的Bax線粒體轉(zhuǎn)位。3、6-OHDA不改變細胞質(zhì)內(nèi)的Bcl-2表達水平,而EPO和TDZD-8兩者也不影響B(tài)cl-2的細胞質(zhì)內(nèi)表達水平。但6-OHDA顯著降低了Bcl-2的線粒體內(nèi)表達水平,而加入EPO和TDZD-8后可逆轉(zhuǎn)6-OHDA誘導的Bcl-2的線粒體內(nèi)表達降低。4、EPO和TDZD-8抑制6-OHDA誘導的細胞凋亡,6-OHDA顯著增加半胱天冬酶3活性,而EPO和TDZD則顯著抑制半胱天冬酶3活性升高。結(jié)論EPO通過促進6-OHDA處理的PC12細胞的GSK3β的磷酸化、從而減少Bax的線粒體轉(zhuǎn)位、以及阻止線粒體內(nèi)Bcl-2水平的降低、降低Caspase 3活性,來抑制6-OHDA誘導的凋亡,進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用,提示EPO是一個很有潛力的神經(jīng)保護藥物。
[Abstract]:The first part 6- of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) induced PC12 cell apoptosis and its possible mechanism by 6- hydroxydopamine (6-hydroxydopamine, 6-OHDA) injury model in vitro of Parkinson disease induced by PC12 cells, and investigate the possible mechanism of 6-OHDA GSK3 beta specific role in apoptosis pathway in 6-OHDA induced apoptosis in PC12. Methods 6- hydroxy dopamine to establish the model of Parkinson's disease in vitro injury induced by PC12 cells was detected by MTT and trypan blue dye exclusion test 6-OHDA after treated with different concentrations of PC12 cell activity and survival rate was determined by Western blot method: 1, total GSK3 and p-GSK3 beta beta level; 2, Bax and beta actin, beta actin as the cytoplasm protein control; 3, Bax and prohibition protein level, prohibition protein was used as a mitochondrial protein loading control. Results after 24 1,6-OHDA stimulation In a dose dependent manner (10,20,50100200 m) cell activity and cell inhibition of PC12 cell survival in 100 M significantly inhibited the activity of PC12 and.2 survival rate of.6-OHDA, Western blot assay showed that 6-OHDA treatment time dependently decreased GSK3 phosphorylation. Check in cell mitochondria Bax the extraction of mitochondria and cytoplasm, showed the decrease of Bax content after 6-OHDA treatment in the cytoplasm, the increase of Bax content in the mitochondria, suggesting that 6-OHDA induced mitochondrial translocation of Bax. Conclusion 6-OHDA significantly decreased the activity of PC12 cells and promote the apoptosis of PC12 cells, GSK3 beta play a certain role in apoptosis induced by 6-OHDA in the 6-OHDA treatment time dependently decreased GSK3 phosphorylation and induce mitochondrial translocation of Bax and Bax from the cytosol translocation to mitochondria, causing mitochondrial dysfunction, and To induce cell apoptosis. The second part of erythropoietin (EPO) to the protective effect and mechanism of 6- hydroxy dopamine induced apoptosis in PC12 cells by glycogen synthase kinase of erythropoietin on 6-OHDA treated PC12 cells 3 beta phosphorylation, mitochondrial translocation of Bax, expression of Bcl-2, caspase 3 activity, to investigate the effect of erythropoietin (EPO) inhibited 6- hydroxydopamine (6-OHDA) mechanism induced apoptosis. Methods PC12 cells with TDZD-8 (25 M) or with different concentrations of EPO (0-10U/m L) pretreatment, followed by 100 M. 6-OHDA was incubated with MTT method and trypan blue exclusion test cell activity after different treatment; observation of GSK3 phosphorylation level by Western blot, total GSK3 levels, the distribution of Bax in the cell, anti proliferation protein levels, Bcl-2 and beta actin levels; Hoechst 33258 was used to estimate the apoptosis of PC12 The proportion of cells, using the caspase 3 assay kit system estimation of caspase 3 activity. Results in 1, EPO in a concentration dependent manner (concentration ranging from 1 to 10U/m L) decreased 6-OHDA induced growth inhibition, GSK3 beta inhibitor 4- phenyl -2- methyl -1,2,4- two - 3,5- two with thiophene ketone (TDZD8).2 significantly reversed 6-OHDA induced growth inhibition, inhibition of EPO and TDZD-8 significantly reversed GSK3 phosphorylation of 6-OHDA, also significantly inhibited 6-OHDA induced Bax mitochondrial translocation of.3,6-OHDA does not change the expression level of Bcl-2 in the cytoplasm, while both EPO and TDZD-8 did not affect the expression level of Bcl-2 in the cytoplasm. But 6-OHDA decreased significantly the expression of Bcl-2 in mitochondria, reducing.4 reversed 6-OHDA induced Bcl-2 expression in mitochondria can join EPO and TDZD-8, EPO and TDZD-8 inhibited 6-OHDA induced apoptosis, 6-OHDA significantly increased caspase 3 activity, While EPO and TDZD inhibited caspase 3 activity increased. Conclusion EPO can promote 6-OHDA PC12 cells treated with GSK3 beta phosphorylation, thereby reducing mitochondrial translocation of Bax, and reduce the level of block Bcl-2 in mitochondria and reduce the activity of Caspase 3, to inhibit 6-OHDA induced apoptosis, and thus play a role in neural protection, suggesting that EPO is a potential neuroprotective drugs.

【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R742.5

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本文編號：1681493