本文選題：低氧　切入點(diǎn)：葡萄糖剝奪　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：迄今為止,腦膠質(zhì)瘤的治療仍無(wú)未獲得突破性進(jìn)展,究其原因主要與腦膠質(zhì)瘤本身所具有的惡性特質(zhì)有關(guān),包括侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā),放療耐受及化療抵抗等方面,已經(jīng)證實(shí)這些惡性特質(zhì)與其所生長(zhǎng)的低氧微環(huán)境密切相關(guān)。大量的研究發(fā)現(xiàn)低氧通過(guò)HIF-1α (hypoxia inducible factor-1α,低氧誘導(dǎo)因子1α)的作用促進(jìn)與血管生成、轉(zhuǎn)移、糖酵解及耐藥相關(guān)等基因的表達(dá),從而賦予腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞更強(qiáng)的惡性生物學(xué)行為。HIF-1α是腫瘤低氧環(huán)境下最重要的轉(zhuǎn)錄因子,它和HIF-1β形成HIF-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體后與許多基因啟動(dòng)子內(nèi)部的HRE結(jié)合,引發(fā)下游基因的轉(zhuǎn)錄,涉及能量代謝、血管生成、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和調(diào)亡、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及治療抵抗�，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮雙向調(diào)控的作用,一方面可促進(jìn)凋亡前體蛋白包括BNIP3、Bax、Bak等的轉(zhuǎn)錄,增強(qiáng)抑癌蛋白p53的穩(wěn)定性從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,另一方面可通過(guò)上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2等因子的作用抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,參與發(fā)揮低氧誘導(dǎo)的凋亡及對(duì)放化療的抵抗。介于HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖中的重要地位,一些研究利用HIF-1α基因沉默的方法對(duì)低氧下腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響開展了相關(guān)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α沉默可在一定程度上增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放化療促凋亡作用,從而推斷HIF-1α是低氧下腦膠質(zhì)瘤產(chǎn)生凋亡逃避及放化療抵抗的主要原因。另外的研究則發(fā)現(xiàn)HIF-1α沉默并未明顯減弱腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡抵抗特性,提示低氧下的凋亡逃避可能是多種基因共同參與下的綜合作用。綜合相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞類型HIF-1α在凋亡逃避中所起的作用有所不同,并且可能與腫瘤細(xì)胞所處的具體低氧環(huán)境差異有關(guān)。突變的p53已失去抑癌作用,而在惡性程度更高的腫瘤組織中,同時(shí)存在突變的p53蛋白的集聚和HIF-1 α的高表達(dá),二者之間有何交互作用,突變的p53的集聚是否僅作為腫瘤惡性程度的標(biāo)志還是對(duì)低氧下的腫瘤細(xì)胞的凋亡逃避發(fā)揮作用,目前仍尚未完全明晰。最近有研究證實(shí)膠質(zhì)瘤等實(shí)體瘤內(nèi)存在梯度低氧現(xiàn)象,并認(rèn)為梯度低氧導(dǎo)致了腫瘤內(nèi)的不均質(zhì)性,表現(xiàn)為遠(yuǎn)隔血管區(qū)域的細(xì)胞惡性程度更高,低氧程度也更為嚴(yán)重,距離血管較近區(qū)域的細(xì)胞惡性程度則較低。對(duì)于腫瘤細(xì)胞耐受低氧的極限,不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞有所不同,嚴(yán)重低氧可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞死亡,也部分細(xì)胞則可能會(huì)從極限低氧環(huán)境中存活。由于受普通培養(yǎng)箱最低氧濃度限制,對(duì)于腦膠質(zhì)細(xì)胞究竟能耐受何種程度的低氧,以及在極度低氧下的細(xì)胞生存狀態(tài)及相關(guān)的分子機(jī)制如何尚缺乏深入的研究?腫瘤細(xì)胞的低氧微環(huán)境中往往伴有能量物質(zhì)的缺乏,由此推測(cè)低氧微環(huán)境中伴隨隨葡萄糖的缺乏,但對(duì)于低氧伴隨葡萄糖缺乏的復(fù)雜環(huán)境下腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控尚缺乏系統(tǒng)深入的研究。并且對(duì)于HIF-1α不同低氧微環(huán)境下腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具體作用及相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究利用最低氧濃度設(shè)置到0.1%的低氧控制器設(shè)定不同低氧濃度模擬腫瘤梯度低氧狀態(tài),同時(shí)結(jié)合葡萄糖剝奪的條件模擬腦膠質(zhì)瘤體內(nèi)生理狀態(tài)下的低氧環(huán)境,系統(tǒng)研究不同低氧環(huán)境下腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的差異,以推測(cè)不同低氧環(huán)境下凋亡抵抗作用的強(qiáng)弱,為篩選不同低氧環(huán)境下的治療靶標(biāo)提供依據(jù)。同時(shí)通過(guò)不同低氧環(huán)境下HIF-1α和mt-p53的表達(dá)變化規(guī)律的研究,推測(cè)二者在其中的可能作用。利用所構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)shRNA干擾HIF-1α的T98G細(xì)胞株,研究HIF-1α沉默對(duì)不同低氧環(huán)境下腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響,再次驗(yàn)證HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞低氧保護(hù)中的作用。更重要的是,通過(guò)研究HIF-1α沉默對(duì)無(wú)糖逆境中腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響,分析HIF-1α干擾及葡萄糖剝奪之間的交互作用,為尋找一種極限低氧環(huán)境下的更為有效治療靶標(biāo)提供依據(jù)及思路。第一部分梯度低氧及葡萄糖剝奪對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖的影響目的：1.探討梯度低氧對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖的影響,尋找低氧誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡的基線水平。1.探討葡萄糖剝奪對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖的影響,研究低氧對(duì)葡萄糖剝奪誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中的作用。方法：1.T98G細(xì)胞分別在不同葡萄糖條件下進(jìn)行梯度低氧(3%O2,0.5O2%,0.1O2%)培養(yǎng),相應(yīng)時(shí)間段顯微鏡下觀察細(xì)胞存活情況。2.培養(yǎng)24h,48h,72h后行Hoechst33342染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況,行AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,分析凋亡率。3.按實(shí)驗(yàn)分組處理24h、48h、72h、96h及120h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,利用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光值(A值),計(jì)算增殖抑制率并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果：1.熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡(Hoechst染色)：各梯度低氧組細(xì)胞均生長(zhǎng)良好,胞核完整,無(wú)明顯細(xì)胞凋亡。常氧無(wú)糖組及各梯度低氧無(wú)糖組48h、72h均有明顯細(xì)胞凋亡,Hoechst33342染色熒光顯微鏡下可見凋亡小體。48小時(shí)凋亡最為明顯的是常氧無(wú)糖組,凋亡較3%02無(wú)糖組0.5%02無(wú)糖組及0.1%02無(wú)糖組明顯,72h凋亡最為明顯的是0.1%低氧無(wú)糖組。常氧無(wú)糖組及各低氧無(wú)糖組均出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變：細(xì)胞體積變小,呈細(xì)長(zhǎng)樹枝狀,突起明顯延長(zhǎng)。2.2 AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：常氧常糖及各低氧常糖在72h內(nèi)均無(wú)明顯細(xì)胞凋亡(P0.05);而各無(wú)糖組(常氧無(wú)糖及各低氧無(wú)糖組)均有明顯細(xì)胞凋亡(P0.01),且隨時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡率遞增(P0.01),3%、0.5%低氧無(wú)糖組細(xì)胞凋亡率明顯低于常氧無(wú)糖組(P0.01)。0.1%低氧無(wú)糖組24h及48h細(xì)胞凋亡率比常氧無(wú)糖組低,但72h時(shí)高于常氧無(wú)糖組(P0.01)。3.MTT結(jié)果：?jiǎn)渭兊脱蹩纱龠M(jìn)T98G細(xì)胞增殖,各低氧常糖組細(xì)胞生長(zhǎng)良好,呈明顯增殖趨勢(shì),與常氧狀態(tài)相比,3%O2及0.5%O2可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖(P0.05),0.1%低氧組增殖速度減慢。常氧無(wú)糖、3%、0.5%和0.1%低氧無(wú)糖下增殖明顯抑制,曲線走勢(shì)差異明顯(P0.01),72h,3%、0.5%低氧無(wú)糖組細(xì)胞抑制程度比常氧無(wú)糖組輕,而0.1%低氧無(wú)糖組細(xì)胞增殖抑制最為顯著。結(jié)論：1.適度低氧促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活及增殖,且當(dāng)氧濃度低至0.1%,72小時(shí)以內(nèi)仍無(wú)明顯凋亡,但較常氧下增殖減慢,提示極限低氧在短期內(nèi)不能作為獨(dú)立因素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的耐低氧的能力。2.葡萄糖剝奪無(wú)論在常氧或者是低氧下均可誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,提示葡萄糖剝奪可獨(dú)立因素誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞快速發(fā)生凋亡,腦膠質(zhì)瘤對(duì)葡萄糖剝奪耐受較差。3.0.5%及以上濃度的適度低氧對(duì)無(wú)糖逆境中腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞有一定的抑凋亡和促增殖作用。極度低氧濃度(0.1%)僅在短期內(nèi)對(duì)無(wú)糖逆境中膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑凋亡作用,但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),這種抗無(wú)糖逆境抑制凋亡的能力將消失。第二部分：不同低氧及葡萄糖條件對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞HIF-1α及mt-p53表達(dá)的調(diào)控及與凋亡的相關(guān)性研究目的：1.探討不同低氧及葡萄糖條件下的腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞中HIF-1α及mt-p53的表達(dá)差異。2.分析不同低氧及葡萄糖條件下的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡與HIF-1α及mt-p53表達(dá)間的可能關(guān)系3.推測(cè)HIF-1α及mt-p53在凋亡抵抗中的可能作用。方法：1.將T98G細(xì)胞置于不同的氧濃度(21%02、0.5%02、0.1%02)及葡萄糖(常糖及無(wú)糖)條件下培養(yǎng)24h、48h、72h,于相應(yīng)時(shí)間段提取總RNA,行real-time PCR檢測(cè)不同氧濃度條件及葡萄糖條件下的HIF-1α的表達(dá)差異。2.將T98G細(xì)胞置于不同的氧濃度(21%02、0.5%02、0.1%02)及葡萄糖(常糖及無(wú)糖)條件下培養(yǎng)24h、48h、72h,于相應(yīng)時(shí)間段提取總蛋白,行Western Blot檢測(cè)各組相應(yīng)時(shí)間段HIF-1α及突變的P53蛋白水平的表達(dá)變化。3.分析不同條件對(duì)HIF-1α及mt-p53的調(diào)控與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖變化的相關(guān)性,推測(cè)二者在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞不同氧濃度及葡萄糖條件下凋亡和增殖中的可能關(guān)系。結(jié)果：1. Real-time PCR結(jié)果顯示：常氧常糖組HIF-1α mRNA三個(gè)時(shí)間段的表達(dá)無(wú)明顯變化。常氧無(wú)糖組的HIF-1α mRNA在24h表達(dá)短暫上調(diào)(P0.01)隨后明顯降低。0.5%低氧無(wú)糖組及0.1%低氧無(wú)糖組的HIF-1α mRNA水平呈逐漸降低的趨勢(shì)。0.1%低氧常糖組在72h則明顯下調(diào)(P0.01)。而0.5%低氧常糖組HIF-1α mRNA表達(dá)水平24h降低,48h后逐漸上調(diào),72h明顯上調(diào)。2. Western-blot結(jié)果示：常氧常糖組HIF-1α 72h內(nèi)保持較低表達(dá)水平,常氧無(wú)糖組24h表達(dá)量與常氧常糖組比較有明顯升高(P0.05),72h降低至較低水平。0.1%低氧常糖組及0.5%低氧常糖組HIF-1α表達(dá)量均于48h上調(diào)(P0.05),72h仍維持在較高水平(P0.05)。0.1%低氧無(wú)糖組及0.5%低氧無(wú)糖組,24h HIF-1α表達(dá)量上調(diào),48h達(dá)最高,72h仍明顯高于常氧常糖組(P0.05)。3.不同培養(yǎng)條件下mt-p53表達(dá)水平：常氧常糖下,mt-p53蛋白在T98G細(xì)胞中有明顯表達(dá),72h內(nèi)未見明顯變化。常氧無(wú)糖組mt-p53蛋白表達(dá)24h下調(diào),72h降至最低水平。0.1%低氧常糖組及0.5%的低氧常糖24h、48h及72h表達(dá)量上調(diào),明顯高于常氧常糖組(P0.05)。0.1%低氧無(wú)糖組及0.5%低氧無(wú)糖于48h開始下調(diào),72h降至較低水平。4.常氧無(wú)糖組HIF-1α蛋白表達(dá)量在72h無(wú)明顯上調(diào),而細(xì)胞凋亡仍持續(xù)增加,而0.1%低氧常糖組及0.5%低氧常糖組72h HIF-1α表達(dá)量明顯上調(diào),凋亡減少,0.5%低氧無(wú)糖組72hHIF-1α表達(dá)量明顯上調(diào),細(xì)胞凋亡少于常氧無(wú)糖組,經(jīng)變量轉(zhuǎn)化后Spearman相關(guān)分析結(jié)果為：細(xì)胞凋亡率變化與HIF-1α表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)(r=-0.707,p0.05)。常氧無(wú)糖組及0.1%低氧常糖組及0.5%低氧常糖組,0.1%低氧無(wú)糖組及0.5%低氧無(wú)糖組mt-p53蛋白的表達(dá)水平的變化與T98G細(xì)胞凋亡率的變化呈負(fù)相關(guān)(r=-0.933,p0.01),即mt-p53蛋白水平降低,細(xì)胞凋亡越增高,蛋白表達(dá)水平增高,細(xì)胞凋亡率降低。低氧常糖組,48h及72h mt-p53蛋白的表達(dá)變化同與HIF-1α的蛋白表達(dá)變化呈正相關(guān)(r=1,p0.01)。結(jié)論：1.極限低氧對(duì)HIF-1α的誘導(dǎo)發(fā)生在蛋白水平,而葡萄糖剝奪對(duì)HI-F1α誘導(dǎo)發(fā)生在mRNA水平。2.低氧對(duì)T98G細(xì)胞抑制凋亡的作用可能與HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān),并且mt-1953在其中起協(xié)同作用,低氧對(duì)T98G無(wú)糖逆境的保護(hù)作用可能緣于HIF-1α及mt-1953蛋白表達(dá)的上調(diào)。3.葡萄糖剝奪對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)的上調(diào)為短期的應(yīng)激反應(yīng)。4.低氧可誘導(dǎo)mt-1953蛋白上調(diào),而葡萄糖剝奪則誘導(dǎo)mt-p53下調(diào)。HIF-1α及mt-p53在低氧下均同時(shí)上調(diào)可能對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞耐極限低氧中有協(xié)同作用。第三部分穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α基因沉默的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立及驗(yàn)證目的：建立慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定HIF-1α干擾的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,并驗(yàn)證其在mRNA水平及蛋白水平的敲降效率。方法：1.慢病毒載體HIF-1α-sh9及HIF-1α-sh10及陰性對(duì)照scrambled shRNA(ctr)經(jīng)測(cè)序鑒定、純化,分別與PCMVΔ 8.1.PMD2-G經(jīng)PEI共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝形成慢病毒顆粒。2.慢病毒感染T98G細(xì)胞系并經(jīng)puromyxin抗性篩選。3.提取總RNA及總蛋白,行real-time PCR及Western Blot檢測(cè),驗(yàn)證HIF-1 α mRNA及蛋白水平的干擾效果,篩選出最有效的慢病毒載體,建立慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α基因沉默的人腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞系。結(jié)果：1.已構(gòu)建的重組慢病毒HIF-1α-shRNA載體9號(hào)(sh9)、10號(hào)(sh10)及陰性對(duì)照測(cè)序(ctr)測(cè)序結(jié)果正確,sh9、sh10及ctr成功包裝成慢病毒顆粒后均可高效感染T98G細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素puromyxin篩選后無(wú)明顯細(xì)胞死亡。2.0.5%低氧下24h兩種質(zhì)粒對(duì)HIF-1α mRNA水平的干擾效率均90%,sh9、sh10分別為97.5%,96.25%。二者在0.5%低氧下,HIF-1α蛋白水平的敲降效率sh9、sh10分別為90.85%,76.59%。結(jié)論：兩種重組慢病毒HIF-1α-shRNA載體可高效并穩(wěn)定干擾T98G細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α的表達(dá)。第四部分慢病毒介導(dǎo)RNA干擾抑制HIF-1a對(duì)低氧下腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及mt-p53表達(dá)的影響目的：1.研究shRNA干擾靶向抑制HIF-1α表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G細(xì)胞系在梯度低氧中增殖和凋亡的作用2. shRNA干擾靶向抑制HIF-1α表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G細(xì)胞系P53表達(dá)的影響,尋找HIF-1α及mt-p53之間可能的交互作用以及子低氧下對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖的相關(guān)性。方法：1.將已構(gòu)建成功的HIF-1α-shRNA T98G細(xì)胞株與陰性對(duì)照的T98G細(xì)胞株分別置于0.5%、0.1%及21%的氧濃度條件下培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MTT檢測(cè),分析其增殖抑制率,繪制生長(zhǎng)曲線。2.于21%、0.5%、0.1%的氧濃度條件下培養(yǎng)24h、48h、72h,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行AnexinV FITC/PI雙染,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析其凋亡率3.同時(shí)行real time-PCR檢測(cè)不同氧濃度條件下HIF-1α-shRNA-T98G細(xì)胞株及陰性對(duì)照T98G細(xì)胞株(ctr-T98G)不同時(shí)間段HIF-1α mRNA表達(dá)水平的差異。4. Western-Blot方法檢測(cè)兩者不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α及mt-p53蛋白水平的表達(dá),分析HIF-1α干擾對(duì)mt-p53表達(dá)的影響及二者的相關(guān)性,分析HIF-1α及mt-p53蛋白水平的表達(dá)與T98G細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)系,探討可能的分子途徑。結(jié)果：1.MTT結(jié)果示：與對(duì)照細(xì)胞相比,無(wú)論是常氧或是0.1%低氧及0.5%低氧下,HIF-1 α基因沉默的T98G細(xì)胞增殖速度均有所減慢(P0.05),并隨時(shí)間的延長(zhǎng)更加明顯。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)：常氧下,HIF-1α基因沉默的T98G細(xì)胞凋亡率較ctr組在各時(shí)間段無(wú)明顯差異(P0.05)。0.1%低氧、0.5%低氧下,HIF-1α基因沉默的T98G細(xì)胞凋亡率在低氧處理48h較ctr組明顯增加,72h更加顯著(P0.05)。3.T98G細(xì)胞中HIF-1α基因在常氧及低氧下mRNA水平及蛋白水平均被有效沉默。在常氧下24h,48h及72h, HIF-1α mRNA水平較對(duì)照組下調(diào)分別達(dá)：96.9%,93.4%,91.5%,二者表達(dá)量均有顯著性差異(P0.01)；HIF-1α蛋白水平的顯著下調(diào)達(dá)：69%,54%,43%。0.5%低氧下,24h,48h及72h,HIF-1α mRNA水平較對(duì)照組下調(diào)分別達(dá)93.5%,92.6%,88.36%：HIF-1α蛋白水平的下調(diào)達(dá)：67.8%,71.1%%,80.5%。0.1%低氧下,24h,48h及72h,HIF-1α mRNA水平較對(duì)照組下調(diào)分別達(dá)：97.5%,94.19%,90.3%,二者差異顯著(P0.01)。HIF-1α蛋白水平的下調(diào)達(dá)50.1%,60.9%,63.4%。Sh組各時(shí)間段較相對(duì)應(yīng)的ctr組mt-p53蛋白均有不同程度的下調(diào)。4.在0.1%低氧及0.5%低氧下HIF-1α蛋白表達(dá)水平與T98G細(xì)胞凋亡率均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.861, p=0.039; r=-0.625, p=0.037),與常氧下細(xì)胞凋亡率之間無(wú)明顯相關(guān)。0.1%氧濃度下及0.5%氧濃度下,HIF-1α表達(dá)與mt-p53表達(dá)呈高度正相關(guān),分別為：r=0.921, p=0.009, r=0.914, p=0.011。而常氧下,二者的表達(dá)則無(wú)相關(guān)性。結(jié)論：1. HIF-1α基因沉默可使人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G增殖速度明顯減慢,但細(xì)胞仍可緩慢增殖。2. HIF-1α基因沉默使低氧下的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G凋亡增多,隨時(shí)間延長(zhǎng)凋亡增加明顯,凋亡率在20%以內(nèi)。3. HIF-1α基因沉默可下調(diào)mt-p53蛋白的表達(dá),二者在低氧下呈正相關(guān)。0.1%低氧及0.5%低氧下HIF-1α蛋白表達(dá)水平與T98G細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)。五部分慢病毒介導(dǎo)RNA干擾抑制HIF-1α表達(dá)對(duì)無(wú)糖逆境中腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及mt-p53表達(dá)的影響目的：1.研究慢病毒介導(dǎo)RNA干擾抑制HIF-1a后,腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞系在常氧無(wú)糖及低氧無(wú)糖中細(xì)胞凋亡和增殖差異,驗(yàn)證HIF-1α對(duì)低氧保護(hù)無(wú)糖逆境中腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。2.研究慢病毒介導(dǎo)RNA干擾抑制HIF-1a對(duì)T98G細(xì)胞在常氧無(wú)糖及低氧無(wú)糖下mt-p53表達(dá)的影響,分析HIF-1a在葡萄糖缺乏下與mt-p53的可能關(guān)系。方法：1.將已構(gòu)建成功的HIF-1α基因敲降的T98G細(xì)胞(shRNA-HIF1α-T98G)細(xì)胞株與陰性對(duì)照(ctr-T98G)細(xì)胞株分別置于常氧常糖,常氧無(wú)糖,0.5%的低氧無(wú)糖下培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MTT檢測(cè),分析其增殖抑制率,繪制生長(zhǎng)曲線。2.于培養(yǎng)24h、48h、72h,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行AnexinV FITC/PI雙染,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析其凋亡率。3.同時(shí)行Western Blot方法檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下shRNA-HIF1α-T98G細(xì)胞株及ctr-T98G細(xì)胞株不同時(shí)間段HIF-1α及mt-p53蛋白水平的表達(dá)水平。4.分析HIF-1α干擾對(duì)mt-p53的影響,探討HIF-1α及p53在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞低氧抗無(wú)糖逆境中的可能作用。結(jié)果：1. shRNA-HIF-1α-T98G及ctr-T98G各時(shí)間段在常氧無(wú)糖下隨時(shí)間延長(zhǎng)增殖明顯抑制,二者間無(wú)顯著性差異(p0.05)。兩者在低氧無(wú)糖下的細(xì)胞增殖也隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯抑制,shRNA-HIF-1α-T98G細(xì)胞增殖抑制程度明顯高于ctr-T98G細(xì)胞,二者間有顯著性差異(p0.05),且高于常氧無(wú)糖下的ctr-T98G細(xì)胞。2. HIF-1α基因敲降的T98G細(xì)胞(shRNA-HIF1α-T98G)及與對(duì)照組細(xì)胞(ctr-T98G)各時(shí)間段在常氧無(wú)糖下均發(fā)生顯著凋亡,并隨時(shí)間延長(zhǎng),凋亡率明顯增加,但二者間無(wú)明顯差異(P0.05)。各時(shí)間段,ctr-T98G在0.5%低氧無(wú)糖下的細(xì)胞凋亡率比常氧無(wú)糖低(P0.05)；但shRNA-HIF1α-T98G細(xì)胞凋亡率明顯高于常氧無(wú)糖下ctr-T98G(P0.05)。3.低氧無(wú)糖下,HIF1α基因敲降后,T98G細(xì)胞凋亡率明顯高于常氧無(wú)糖下,說(shuō)明低氧抗無(wú)糖逆境的作用隨著HIF1α的敲降而喪失,同時(shí)mt-p53的表達(dá)隨之下調(diào),提示在低氧無(wú)糖下mt-p53的表達(dá)受HIF1α的調(diào)控。而常氧無(wú)糖下,HIF1α基因敲降并未引起T98G細(xì)胞的凋亡率及mt-p53的表達(dá)的明顯變化。結(jié)論：HIF-1α參與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞低氧抗無(wú)糖逆境作用,HIF-1α表達(dá)上調(diào)減少了無(wú)糖逆境誘發(fā)的細(xì)胞凋亡,并調(diào)控mt-p53的表達(dá),但mt-p53在低氧抗無(wú)糖逆境作用仍不明確。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.41

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