本文選題：IL-27　切入點(diǎn)：CCL5　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：背景與目的：多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）自身免疫性疾病，炎癥反應(yīng)在其疾病發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。白細(xì)胞介素-27（Interleukin-27，IL-27）是近年來新發(fā)現(xiàn)的IL-12家族成員之一，主要由激活的抗原遞呈細(xì)胞APC、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞DCs分泌產(chǎn)生。自IL-27被發(fā)現(xiàn)以來，已顯示出在免疫反應(yīng)調(diào)控中的獨(dú)特作用：誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化，抑制Th2細(xì)胞和Th17細(xì)胞的發(fā)育；在高度Th1細(xì)胞極化時(shí)，IL-27的主要作用是限制Th1型免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，從而保護(hù)機(jī)體免受過度的免疫反應(yīng)的損傷，同時(shí)具有促炎與抗炎的雙重特征。炎癥性趨化因子5（RANTES/CCL5）是T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的炎性趨化因子之一，可以誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附并穿過血腦屏障（Blood-brainbarrier，BBB）進(jìn)入CNS，從而引起一系列的炎癥反應(yīng)和繼發(fā)病變。研究發(fā)現(xiàn)，在緩解-復(fù)發(fā)型MS中，抑制CCL5的表達(dá)可以預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)。目前，有很多國(guó)內(nèi)外研究及報(bào)道提示，在自身免疫性炎癥性疾病中，機(jī)體內(nèi)IL-27和CCL5存在一定的相關(guān)性，但目前并無其具體機(jī)制的相關(guān)研究及報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過在體實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎（experimental autoimmune cerebrospinal meningitis，EAE）模型和離體培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞探索CCL5在EAE病變進(jìn)程中受IL-27的變化調(diào)控的影響，并探索其機(jī)制，為預(yù)防MS的疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)提供臨床指導(dǎo)。 方法： 第一部分：將40只健康雌性C57BL/6小鼠用MOG31-55多肽免疫后0d、7d、15d、21d（每組10只），每天測(cè)其體重并觀察老鼠行為學(xué)變化，用蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）觀察小鼠CNS中的炎癥情況；用Western bloting（WB）和免疫組織化學(xué)方法測(cè)量IL-27和CCL5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)。將50只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、EAE組、IL-27+EAE組、SC144（IL-27受體拮抗劑）+EAE組、PBS（磷酸緩沖液）+EAE組，用WB和PCR方法測(cè)量CCL5的表達(dá)量。 第二部分：用3%巰基乙酸鹽（每只1毫升）腹腔注射C57BL/6小鼠3d后，取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。分別對(duì)原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，加入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）炎性刺激因子誘導(dǎo)mCCL5的表達(dá)，加入重組IL-27和SC144進(jìn)行干預(yù)調(diào)控，收取細(xì)胞用realtime PCR測(cè)定CCL5mRNA的表達(dá)量及半衰期，用WB測(cè)量IFN-γ和NF-κB的蛋白表達(dá)；收取細(xì)胞培養(yǎng)液，用ELISA測(cè)定CCL5的表達(dá)量。 結(jié)果： 1、EAE小鼠最早在免疫后12天開始發(fā)病，大多數(shù)均集中在14～18天發(fā)病，并于2～4天后達(dá)到疾病高峰，在發(fā)病高峰期時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分均數(shù)為2.38±0.52。 2、HE染色示正常組小鼠脊髓無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，血管周圍有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，呈典型“血管袖套樣”改變，且實(shí)質(zhì)內(nèi)亦有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)的細(xì)胞類型以淋巴細(xì)胞為主，也可見少量膠質(zhì)細(xì)胞。 3、在EAE疾病的過程中，EAE小鼠腦白質(zhì)中IL-27的表達(dá)量逐漸增高；而CCL5的表達(dá)量先升高后降低。與EAE模型組和對(duì)照組相比，IL-27干預(yù)組神經(jīng)功能評(píng)分明顯較降低，疾病高峰期相對(duì)延后，CCL5表達(dá)水平明顯受到抑制（P0.05）；SC144干預(yù)組神經(jīng)功能評(píng)分明顯較高，疾病高峰期相對(duì)提前，CCL5表達(dá)水平明顯升高（P0.05）。 4、在細(xì)胞水平，與正常對(duì)照組相比，LPS組、LPS+IL-27刺激組、LPS+SC144+IL-27組CCL5的表達(dá)均增多；與LPS刺激組和LPS+SC144+IL-27組比較，LPS+IL-27刺激組CCL5mRNA表達(dá)明顯下降（P0.05），CCL5mRNA的半衰期縮短（P0.05）。 5、與正常對(duì)照組相比， LPS組、 LPS+IL-27刺激組、LPS+SC144+IL-27組IFN-γ和NF-κB的表達(dá)均增多（P0.05）；與LPS刺激組和LPS+SC144+IL-27組比較，LPS+IL-27刺激組IFN-γ和NF-κB表達(dá)明顯下降（P0.05）。 結(jié)論：在小鼠自身免疫性腦脊髓膜炎疾病進(jìn)展期，IL-27加速CCL5mRNA的半衰期，從而在mRNA和蛋白水平抑制CCL5的表達(dá)，并發(fā)揮抗炎作用，其具體機(jī)制至少部分是基于抑制IFN-γ的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。鑒于CCL5誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附并穿過血腦屏障進(jìn)入CNS引起一系列的炎癥反應(yīng)和繼發(fā)病變，，干預(yù)IL-27的表達(dá)為抑制多發(fā)性硬化MS疾病進(jìn)展并預(yù)防疾病復(fù)發(fā)提供新的臨床指導(dǎo)。
[Abstract]:Background and objective: multiple sclerosis (Multiple sclerosis MS) is a central nervous system (Central nervous system, CNS) autoimmune diseases, inflammatory reaction in the disease occurrence and development plays an important role in the process. Interleukin -27 (Interleukin-27, IL-27) is a member of IL-12 family in recent years, mainly by activated antigen-presenting cells APC, secreted by macrophages and dendritic cells DCs. Since IL-27 was discovered, has demonstrated the unique role in immune response regulation in the differentiation of Th1 cells, the inhibition of Th2 cells and Th17 cells in Th1 cell development; highly polarized, mainly the role of IL-27 is to limit the immune response to Th1 intensity and duration, thereby protecting the body from excessive immune response and damage, which has the characteristics of both pro-inflammatory and anti-inflammatory. Inflammatory chemokine 5 (RANTES/C CL5) is an inflammatory T lymphocyte chemotactic factor, can induce leukocyte adhesion and blood-brain barrier (Blood-brainbarrier, BBB) into the CNS, causing inflammation and secondary lesions. A series of studies found that in relapsing remitting MS, inhibiting the expression of CCL5 can prevent the recurrence of the disease. At present, there are many domestic and foreign research and reports suggest that in autoimmune inflammatory diseases, IL-27 and CCL5 in the body there is a certain correlation, but there is no related report and study its mechanism. Through this experiment in experimental autoimmune encephalomyelitis (experimental autoimmune cerebrospinal meningitis, EAE) model in vitro culture of peritoneal macrophages and explore the regulation of IL-27 CCL5 is affected by changes in EAE lesions in the process, and to explore its mechanism, to provide clinical guidance for the prevention of MS disease progression and recurrence.
Method錛

本文編號(hào)：1680429