發(fā)布時間：2018-03-29 01:36

  本文選題：癲癇持續(xù)狀態(tài)　切入點：miRNA　出處：《泰山醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文

【摘要】：目的 癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見病，目前影響著全球0.5%~1%的人群。選擇性神經(jīng)元死亡和苔蘚纖維芽生等病理生理過程與癲癇的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小RNA，它通過誘導(dǎo)沉默復(fù)合體形成來降解靶mRNA，或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近越來越多的文獻報道，miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極為重要的作用。本實驗通過建立杏仁核點燃癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的動物實驗來探討海馬miRNA表達譜的變化，并且對癲癇持續(xù)狀態(tài)后差異表達的miRNA與海馬神經(jīng)元凋亡的關(guān)系進行了評估。 研究方法 1、首先選用6~8周齡健康雄性SD大鼠，建立杏仁核點燃大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，于造模成功后24小時提取大鼠腦組織海馬區(qū)miRNA，采用高通量測序技術(shù)研究癲癇持續(xù)狀態(tài)后大鼠海馬區(qū)腦組織與正常大鼠海馬區(qū)腦組織中miRNA表達譜的差異。 2、隨后將篩選出的差異表達明顯的6個miRNA用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)進行驗證。 3、應(yīng)用靶基因預(yù)測軟件（RNAhybrid和miRand）對以上6個miRNA的目的候選靶mRNA進行了預(yù)測，并使用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）進行通路分析。 4、最后檢測此6個miRNA在癲癇持續(xù)狀態(tài)后不同時間點（4小時，24小時，1周和3周）的動態(tài)變化，與此同時應(yīng)用Nissel染色和TUNEL（Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP end-labeling assay）染色檢測癲癇持續(xù)狀態(tài)后不同時間點海馬神經(jīng)元生存和凋亡情況，進一步評估篩選出的miRNA是否與癲癇持續(xù)狀態(tài)后神經(jīng)元凋亡有關(guān)。 結(jié)果 1、杏仁核點燃癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠和對照組正常大鼠海馬組織差異表達的miRNA：在癲癇持續(xù)狀態(tài)后24小時檢測出差異表達的miRNA共37個，其中上調(diào)的miRNA有34個，，下調(diào)的有3個。進一步篩選出在癲癇持續(xù)狀態(tài)后變化大于2倍的（P＜0.01且P≠0）6個miRNA (miR-874-3p, miR-20a-5p, miR-345-3p, miR-365-5p, miR-764-3p andmiR-99b-3p)，在以上6個篩選出的miRNA中，上調(diào)的miRNA表達差異最大的是miR-879-5p （4.177倍），差異最小的是miR-764-3p （2.078倍），下調(diào)大于2倍的是miR-99b-3p。 2、采用qRT-PCR對結(jié)果進行驗證：將篩選出的變化明顯的6個miRNA進行qRT-PCR驗證，miR-874-3p, miR-20a-5p, miR-345-3p, miR-365-5p, miR-764-3p的表達量與正常對照組相比明顯增高，而miR-99b-3p的表達量明顯下降，此與高通量測序結(jié)果一致。 3、靶基因預(yù)測：利用RNAhybrid和miRand兩個靶基因預(yù)測軟件對篩選出的6個miRNA的靶mRNA進行預(yù)測，KEGG通路分析進一步顯示此6個miRNA的靶基因在癲癇持續(xù)狀態(tài)后凋亡通路中發(fā)揮十分重要的作用。 4、miRNA的動態(tài)變化和Nissel染色及TUNEL染色的病理結(jié)果：以上miRNA在癲癇持續(xù)狀態(tài)后1周表達量的變化最明顯，Nissel染色及TUNEL染色結(jié)果顯示在癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦組織生存神經(jīng)元減少，凋亡神經(jīng)元增多，且在癲癇持續(xù)狀態(tài)后1周時最明顯，這與篩選出的miRNA的動態(tài)變化相一致。進一步分析miRNA和癲癇持續(xù)狀態(tài)后凋亡的關(guān)系顯示miR-365-5p和miR-99b-3p的差異表達水平與癲癇持續(xù)狀態(tài)后神經(jīng)元凋亡具有明顯相關(guān)性。 結(jié)論 大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后，海馬區(qū)腦組織中miRNA的表達量發(fā)生明顯變化，并且差異表達的miRNA是癲癇持續(xù)狀態(tài)后神經(jīng)元凋亡重要的調(diào)節(jié)因子。
[Abstract]:objective
Epilepsy is a common disease of the central nervous system, currently affecting the global 0.5%~1% population. Selective neuronal death and mossy fiber sprouting in the pathophysiological processes of epilepsy and the occurrence and development of.MicroRNA (miRNA) is a kind of endogenous with regulationfunction encoding non small RNA, it can induce silencing complex formation to degradation of target mRNA. Or repression of target mRNA translation. More recent reports in the literature, miRNA in the central nervous system disease development plays an extremely important role. By establishing the animal experiment of amygdala kindling epileptic state model to explore the expression of hippocampal miRNA, and assess the relationship of miRNA expression of epilepsy after status epilepticus and apoptosis of hippocampus neurons.
research method
1, the first 6~8 weeks old healthy male SD rats to establish rat amygdala kindling model of status epilepticus, 24 hours after the success in modeling the extraction of brain tissue in rats hippocampus miRNA, using high-throughput sequencing technology to study epilepsy expression profiling of miRNA in hippocampus of rats with brain tissue and brain tissue in the hippocampus of normal rats.
2, then the 6 differentially expressed miRNA were identified by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR).
3, we applied the target gene prediction software (RNAhybrid and miRand) to predict the above 6 miRNA target candidate mRNA, and used KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) to conduct path analysis.
4, finally detect the 6 miRNA at different time points after status epilepticus (4 hours, 24 hours, 1 weeks and 3 weeks) the dynamic changes at the same time, using Nissel staining and TUNEL (Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP end-labeling assay) were detected at different time points after status epilepticus in hippocampal neuron survival and apoptosis, further evaluation whether the selected miRNA and status epilepticus induced neuronal apoptosis.
Result
1, status epilepticus rats and expression of hippocampus of rats in the control group of normal miRNA in amygdala kindled epileptic state after 24 hours to detect the expression of miRNA in a total of 37, which increased 34 in miRNA, down 3. Further screened in status epilepticus after changes greater than 2 times (P < 0.01 and P = 0) and 6 miRNA (miR-874-3p, miR-20a-5p, miR-345-3p, miR-365-5p, miR-764-3p, andmiR-99b-3p) in more than 6 screened miRNA, upregulation of miRNA expression of miR-879-5p was the highest (4.177 times), the difference is the smallest miR-764-3p (2.078 times), down more than 2 times is miR-99b-3p.
2, using qRT-PCR to verify the results: 6 the change of miRNA screened obvious qRT-PCR validation, miR-874-3p, miR-20a-5p, miR-345-3p, miR-365-5p, miR-764-3p expression was significantly increased compared with normal control group, while the expression of miR-99b-3p was obviously decreased, the sequencing results were consistent with the high throughput.
3, target gene prediction: we use RNAhybrid and miRand two target gene prediction software to predict the target miRNA of 6 miRNA targets. KEGG pathway analysis further shows that these 6 miRNA target genes play a very important role in the apoptotic pathway after status epilepticus.
4, the pathological results of the dynamic changes of miRNA and Nissel staining and TUNEL staining: more than miRNA in status epilepticus after 1 weeks, the expression of the most obvious, Nissel staining and TUNEL staining showed reduced survival of neurons in hippocampus in epileptic state, the apoptosis of neurons increased, and in 1 weeks after epilepsy continue to state the most obvious, consistent with the dynamic changes of the screened miRNA. Further analysis of miRNA and apoptosis after status epilepticus relationship differences between miR-365-5p and miR-99b-3p expression and neuronal apoptosis after status epilepticus has obvious relevance.
conclusion
After the status epilepticus in rats, the expression level of miRNA in hippocampal area changed significantly, and the differential expression of miRNA was an important regulator of neuronal apoptosis after status epilepticus.

【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1

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本文編號：1679006