本文選題：神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤　切入點(diǎn)：甘草酸　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：背景：神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的腫瘤,占成年人顱內(nèi)腫瘤的35%～50%。而惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤占所有膠質(zhì)瘤的60%。由于其呈浸潤性生長,單純手術(shù)切除往往難以根治,且術(shù)后復(fù)發(fā)率高,平均生存期僅14個(gè)月。目前,除手術(shù)干預(yù)及輔助放療,化療和生物治療仍是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主要策略。只有小部分患者能從增加替莫唑胺治療劑量中獲益,而大劑量的替莫唑胺無疑加大了藥物對(duì)人體的毒性作用。膠質(zhì)瘤對(duì)多種抗腫瘤極易產(chǎn)生耐藥,化療藥物的使用也未能延長患者的中位生存期。因此有必要尋找一種新的治療藥物并探索其機(jī)制,以期提高對(duì)膠質(zhì)瘤的治療療效。甘草酸(Glycyrrhizin,即Glycyrrhizic acid)是從植物甘草中提取的天然五環(huán)三萜類化合物,通常用于預(yù)防和治療慢性病毒性肝炎。研究發(fā)現(xiàn),甘草酸有抗?jié)�、祛痰、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗癌、神�?jīng)保護(hù)和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效。在多種腫瘤細(xì)胞細(xì)胞系中,如肝癌、白血病、胃癌、及前列腺癌,甘草酸還可以通過下調(diào)NF-κB (p65)的表達(dá)誘導(dǎo)凋亡過程。還可以提高多種抗腫瘤藥物,如環(huán)磷酰胺、長春新堿、喜樹堿的抗癌活性,并可降低化療藥物的毒副作用。早在上世紀(jì)50年代末至60年代初就發(fā)現(xiàn)甘草酸有明確的抗腫瘤作用。然而,甘草酸是否有抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用,國內(nèi)外尚未見報(bào)道。體內(nèi)外的研究表明,核因子κ. B (nuclear factor kappa B, NF-κB)是一種關(guān)鍵的多顯性核轉(zhuǎn)錄因子,廣泛分布在細(xì)胞中,屬于Rel基因家族,參與多種疾病的病理過程,控制膠質(zhì)瘤擴(kuò)散及高級(jí)別膠質(zhì)瘤生長的基因也接受NF-κB的調(diào)控。越來越多的證據(jù)表明NF-κB在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中持續(xù)激活。在所有時(shí)期的星形細(xì)胞瘤細(xì)胞及高級(jí)別的星形細(xì)胞瘤中均能檢測到活化的NF-κB。且在復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,NF-κB的活化水平明顯高于原發(fā)的膠質(zhì)瘤,提示NF-κB可能與膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。更重要的是,活化的NF-κB能夠激活多種基因的轉(zhuǎn)錄,包括編碼細(xì)胞因子和粘附因子的基因,及決定腫瘤發(fā)生和發(fā)展的基因。NF-κB活化主要是通過p50/p65亞基組成的二聚體脫離與抑制性κB蛋白的結(jié)合,并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)實(shí)現(xiàn)。Fas-L、IFN-β、IL-8和IP-10基因的啟動(dòng)子及HIV-1基因的增強(qiáng)子是NF-κB最常見的DNA結(jié)合位點(diǎn)。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、凋亡、免疫應(yīng)答等密切相關(guān),并且甘草酸能通過下調(diào)P65的表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系凋亡。因此,我們研究甘草酸處理U251細(xì)胞后NF-κB活性亞基p65蛋白在細(xì)胞核中的改變。 目的：觀察甘草酸(Glycyrrhizic acid, GA)對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并通過檢測NF-κB活性亞基p65在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的變化,探討甘草酸抑制膠質(zhì)瘤增殖的可能機(jī)制,為進(jìn)一步研究甘草酸治療膠質(zhì)瘤提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1、細(xì)胞培養(yǎng)：人膠質(zhì)瘤母細(xì)胞系U251復(fù)蘇后在含10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基中于37。C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,3-4天傳代一次,用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。2、CCK-8法檢測細(xì)胞生存率：取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,胰酶消化后混懸,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,接種于96孔板,每孔100μl,含3×103個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后,將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為空白對(duì)照液和不同濃度的甘草酸溶液,各實(shí)驗(yàn)組甘草酸濃度為1、2、4mmol/L,每組3個(gè)復(fù)孔,置于37。C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于培養(yǎng)24、48、72h更換為DMEM培養(yǎng)基,同時(shí)每孔加入10u l CCK-8溶液,恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h,用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長450nm處讀取各孔光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,并計(jì)算其平均值,細(xì)胞生存率計(jì)算公式如下：細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組OD值—本底組OD值)／(對(duì)照組OD值—本底組OD值)×100%,繪制生長抑制曲線圖,并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3、平板克隆實(shí)驗(yàn)：克隆形成是測定細(xì)胞增殖能力的常用方法,單個(gè)細(xì)胞在體外傳代6次以上形成的細(xì)胞群成為克隆,一個(gè)克隆的大小約0.3-1.Omm,本實(shí)驗(yàn)采用平皿法,用含EDTA的胰酶將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液,并以每孔300個(gè)細(xì)胞的密度接種于25cm2的塑料培養(yǎng)皿中。細(xì)胞在含有不同濃度甘草酸(0、1、2、4mmol/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育10天后,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗2次后,甲醇固定30分鐘,沖洗后予龍膽紫染色,100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中所有紫色斑點(diǎn)。4、細(xì)胞凋亡檢測：根據(jù)細(xì)胞生存率結(jié)果,選取48小時(shí)作為檢測細(xì)胞凋亡的特定時(shí)間點(diǎn)。4.1、倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),Hoechst33258染色U251細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)：PBS沖洗細(xì)胞3次,對(duì)照組及甘草酸處理組細(xì)胞予Hoechst33258室溫黑暗環(huán)境下染色l0min。再次予PBS沖洗細(xì)胞3次后,340nm波長的熒光顯微鏡下拍照并觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。4.2、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡率：離心細(xì)胞,預(yù)冷的PBS沖洗,用100μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,各組加入2μlAnnexin V-FITC及2μ1的碘化丙啶的混合液,4。C黑暗環(huán)境下孵育15min后立即在流式細(xì)胞儀中行計(jì)數(shù)分析,記錄每組早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。5、蛋白免疫印跡檢測：不同濃度的甘草酸(0、1、2、4mM)處理U251細(xì)胞48小時(shí),收集各組細(xì)胞核蛋白。按每泳道50u g蛋白質(zhì)上樣,經(jīng)8%的SDS-PA分離電泳蛋白質(zhì),濕轉(zhuǎn)致聚偏氟乙烯膜,5%脫脂奶粉封閉,以兔抗人P65抗體一抗4。C過夜,洗膜數(shù)次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1小時(shí),用增強(qiáng)的發(fā)光液可視化蛋白質(zhì)條帶,并行X線膠片曝光,UN-SCAN-IT凝膠分析軟件獲取條帶顯影密度,并計(jì)算各條帶密度與相應(yīng)內(nèi)參histone H3的比值。6、免疫熒光檢測：U251細(xì)胞接種至96孔板,2mmol/L的甘草酸處理48小時(shí),4%多聚甲醛固定細(xì)胞,隨即以10%的山羊血清封閉1小時(shí)。P65抗體4。C過夜孵育,次日PBS沖洗3次,每次20分鐘,以含有Alexa Fluor488熒光的山羊抗兔抗體(1：500)孵育,同時(shí)用DAPI著色細(xì)胞核,并在熒光顯微鏡下拍照。7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件。除特殊說明外,含有誤差線(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)的數(shù)據(jù)代表三次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析,以p0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1、甘草酸抑制U251細(xì)胞增殖及克隆形成能力：1.1、甘草酸呈劑量和時(shí)間依賴性抑制U251細(xì)胞增殖：甘草酸作用24、48、72小時(shí)對(duì)U251細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為3.67、1.37、1.09mmol/L;1.2、U251細(xì)胞種植在25cm2塑料培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)10天后,0、1、2、4mmol/L的甘草酸對(duì)U251細(xì)胞的克隆抑制率分別為91.6±4.4、81.2±5.0、45.5±5.1和30.7±6.5%,提示甘草酸對(duì)U251克隆形成的抑制能力有濃度依賴性趨勢。2、甘草酸誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡：采用Hoechst33258染色及流式細(xì)胞術(shù)觀察甘草酸誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡。2.1熒光顯微鏡及倒置相差顯微鏡分別用以觀察細(xì)胞核和細(xì)胞整體形態(tài)的改變。正常對(duì)照組細(xì)胞呈不規(guī)則梭形,突觸較多,折光度好,胞漿豐富,邊緣清晰,與培養(yǎng)皿黏合緊密。細(xì)胞核均勻著色,2mmol/L甘草酸處理48小時(shí)后,多數(shù)細(xì)胞變圓、皺縮、變圓毛刺、折光度降低,細(xì)胞核碎裂,可見典型的凋亡小體。以上形態(tài)學(xué)的改變提示甘草酸有誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡的作用。2.2、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：0、1、2、4mmol/L的甘草酸處理U251細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞凋亡率分別為：3.30±0.98、14.97±2.67、27.53±5.51和55.90±5.1%,可見細(xì)胞凋亡率隨甘草酸濃度的增加而增加。3、甘草酸處理后,p65蛋白在U251細(xì)胞中的表達(dá)及分布：蛋白免疫印跡結(jié)果提示p65蛋白在對(duì)照組呈較高表達(dá)(2.83±0.38),而在甘草酸處理組,p65蛋白表達(dá)顯著降低(1.91±0.31,1.43±0.28,0.94±0.22),各甘草酸處理組與對(duì)照組的蛋白表達(dá)水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(1mM, P0.05;2mM, P0.01;4mM, P0.01)。此外,采用抗p65抗體的免疫熒光結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞核p65的熒光強(qiáng)度較強(qiáng),而2mmol/L的甘草酸處理48小時(shí)后,U251細(xì)胞核p65的熒光強(qiáng)度變?nèi)酢?結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘草酸通過抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)為甘草酸治療膠質(zhì)瘤的臨床藥物研究提供依據(jù)。除此之外,甘草酸對(duì)NF-κB抑制作用為對(duì)抗NF-κB相關(guān)疾病提供新的治療策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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