本文選題：神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤　切入點：甘草酸　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：背景：神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的腫瘤,占成年人顱內(nèi)腫瘤的35%～50%。而惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤占所有膠質(zhì)瘤的60%。由于其呈浸潤性生長,單純手術切除往往難以根治,且術后復發(fā)率高,平均生存期僅14個月。目前,除手術干預及輔助放療,化療和生物治療仍是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主要策略。只有小部分患者能從增加替莫唑胺治療劑量中獲益,而大劑量的替莫唑胺無疑加大了藥物對人體的毒性作用。膠質(zhì)瘤對多種抗腫瘤極易產(chǎn)生耐藥,化療藥物的使用也未能延長患者的中位生存期。因此有必要尋找一種新的治療藥物并探索其機制,以期提高對膠質(zhì)瘤的治療療效。甘草酸(Glycyrrhizin,即Glycyrrhizic acid)是從植物甘草中提取的天然五環(huán)三萜類化合物,通常用于預防和治療慢性病毒性肝炎。研究發(fā)現(xiàn),甘草酸有抗?jié)�、祛痰、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗癌、神�?jīng)保護和增強機體免疫力的功效。在多種腫瘤細胞細胞系中,如肝癌、白血病、胃癌、及前列腺癌,甘草酸還可以通過下調(diào)NF-κB (p65)的表達誘導凋亡過程。還可以提高多種抗腫瘤藥物,如環(huán)磷酰胺、長春新堿、喜樹堿的抗癌活性,并可降低化療藥物的毒副作用。早在上世紀50年代末至60年代初就發(fā)現(xiàn)甘草酸有明確的抗腫瘤作用。然而,甘草酸是否有抗膠質(zhì)母細胞瘤的作用,國內(nèi)外尚未見報道。體內(nèi)外的研究表明,核因子κ. B (nuclear factor kappa B, NF-κB)是一種關鍵的多顯性核轉(zhuǎn)錄因子,廣泛分布在細胞中,屬于Rel基因家族,參與多種疾病的病理過程,控制膠質(zhì)瘤擴散及高級別膠質(zhì)瘤生長的基因也接受NF-κB的調(diào)控。越來越多的證據(jù)表明NF-κB在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤細胞中持續(xù)激活。在所有時期的星形細胞瘤細胞及高級別的星形細胞瘤中均能檢測到活化的NF-κB。且在復發(fā)的膠質(zhì)瘤細胞中,NF-κB的活化水平明顯高于原發(fā)的膠質(zhì)瘤,提示NF-κB可能與膠質(zhì)瘤復發(fā)相關。更重要的是,活化的NF-κB能夠激活多種基因的轉(zhuǎn)錄,包括編碼細胞因子和粘附因子的基因,及決定腫瘤發(fā)生和發(fā)展的基因。NF-κB活化主要是通過p50/p65亞基組成的二聚體脫離與抑制性κB蛋白的結(jié)合,并轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)實現(xiàn)。Fas-L、IFN-β、IL-8和IP-10基因的啟動子及HIV-1基因的增強子是NF-κB最常見的DNA結(jié)合位點。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移、復發(fā)、凋亡、免疫應答等密切相關,并且甘草酸能通過下調(diào)P65的表達誘導前列腺癌細胞系凋亡。因此,我們研究甘草酸處理U251細胞后NF-κB活性亞基p65蛋白在細胞核中的改變。 目的：觀察甘草酸(Glycyrrhizic acid, GA)對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細胞增殖和凋亡的影響,并通過檢測NF-κB活性亞基p65在細胞核內(nèi)表達的變化,探討甘草酸抑制膠質(zhì)瘤增殖的可能機制,為進一步研究甘草酸治療膠質(zhì)瘤提供理論基礎和實驗依據(jù)。 方法：1、細胞培養(yǎng)：人膠質(zhì)瘤母細胞系U251復蘇后在含10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基中于37。C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,3-4天傳代一次,用于實驗的細胞均處于對數(shù)生長期。2、CCK-8法檢測細胞生存率：取對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化后混懸,細胞計數(shù)板計數(shù)后,接種于96孔板,每孔100μl,含3×103個細胞。待細胞貼壁后,將細胞培養(yǎng)液更換為空白對照液和不同濃度的甘草酸溶液,各實驗組甘草酸濃度為1、2、4mmol/L,每組3個復孔,置于37。C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于培養(yǎng)24、48、72h更換為DMEM培養(yǎng)基,同時每孔加入10u l CCK-8溶液,恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h,用全自動酶標儀在波長450nm處讀取各孔光密度(OD)值。實驗重復三次,并計算其平均值,細胞生存率計算公式如下：細胞生存率=(實驗組OD值—本底組OD值)／(對照組OD值—本底組OD值)×100%,繪制生長抑制曲線圖,并作統(tǒng)計學分析。3、平板克隆實驗：克隆形成是測定細胞增殖能力的常用方法,單個細胞在體外傳代6次以上形成的細胞群成為克隆,一個克隆的大小約0.3-1.Omm,本實驗采用平皿法,用含EDTA的胰酶將處于對數(shù)生長期的細胞消化為單細胞懸液,并以每孔300個細胞的密度接種于25cm2的塑料培養(yǎng)皿中。細胞在含有不同濃度甘草酸(0、1、2、4mmol/L)的細胞培養(yǎng)液中孵育10天后,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗2次后,甲醇固定30分鐘,沖洗后予龍膽紫染色,100倍顯微鏡下計數(shù)培養(yǎng)皿中所有紫色斑點。4、細胞凋亡檢測：根據(jù)細胞生存率結(jié)果,選取48小時作為檢測細胞凋亡的特定時間點。4.1、倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài),Hoechst33258染色U251細胞,熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)：PBS沖洗細胞3次,對照組及甘草酸處理組細胞予Hoechst33258室溫黑暗環(huán)境下染色l0min。再次予PBS沖洗細胞3次后,340nm波長的熒光顯微鏡下拍照并觀察細胞核形態(tài)學變化。4.2、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率：離心細胞,預冷的PBS沖洗,用100μl的結(jié)合緩沖液重懸細胞,各組加入2μlAnnexin V-FITC及2μ1的碘化丙啶的混合液,4。C黑暗環(huán)境下孵育15min后立即在流式細胞儀中行計數(shù)分析,記錄每組早期凋亡及晚期凋亡細胞所占百分數(shù)。5、蛋白免疫印跡檢測：不同濃度的甘草酸(0、1、2、4mM)處理U251細胞48小時,收集各組細胞核蛋白。按每泳道50u g蛋白質(zhì)上樣,經(jīng)8%的SDS-PA分離電泳蛋白質(zhì),濕轉(zhuǎn)致聚偏氟乙烯膜,5%脫脂奶粉封閉,以兔抗人P65抗體一抗4。C過夜,洗膜數(shù)次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1小時,用增強的發(fā)光液可視化蛋白質(zhì)條帶,并行X線膠片曝光,UN-SCAN-IT凝膠分析軟件獲取條帶顯影密度,并計算各條帶密度與相應內(nèi)參histone H3的比值。6、免疫熒光檢測：U251細胞接種至96孔板,2mmol/L的甘草酸處理48小時,4%多聚甲醛固定細胞,隨即以10%的山羊血清封閉1小時。P65抗體4。C過夜孵育,次日PBS沖洗3次,每次20分鐘,以含有Alexa Fluor488熒光的山羊抗兔抗體(1：500)孵育,同時用DAPI著色細胞核,并在熒光顯微鏡下拍照。7、統(tǒng)計學分析：統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件。除特殊說明外,含有誤差線(均數(shù)±標準差)的數(shù)據(jù)代表三次實驗的結(jié)果。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析,以p0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果：1、甘草酸抑制U251細胞增殖及克隆形成能力：1.1、甘草酸呈劑量和時間依賴性抑制U251細胞增殖：甘草酸作用24、48、72小時對U251細胞的半數(shù)抑制濃度分別為3.67、1.37、1.09mmol/L;1.2、U251細胞種植在25cm2塑料培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)10天后,0、1、2、4mmol/L的甘草酸對U251細胞的克隆抑制率分別為91.6±4.4、81.2±5.0、45.5±5.1和30.7±6.5%,提示甘草酸對U251克隆形成的抑制能力有濃度依賴性趨勢。2、甘草酸誘導U251細胞凋亡：采用Hoechst33258染色及流式細胞術觀察甘草酸誘導U251細胞凋亡。2.1熒光顯微鏡及倒置相差顯微鏡分別用以觀察細胞核和細胞整體形態(tài)的改變。正常對照組細胞呈不規(guī)則梭形,突觸較多,折光度好,胞漿豐富,邊緣清晰,與培養(yǎng)皿黏合緊密。細胞核均勻著色,2mmol/L甘草酸處理48小時后,多數(shù)細胞變圓、皺縮、變圓毛刺、折光度降低,細胞核碎裂,可見典型的凋亡小體。以上形態(tài)學的改變提示甘草酸有誘導U251細胞凋亡的作用。2.2、流式細胞術檢測細胞凋亡率：0、1、2、4mmol/L的甘草酸處理U251細胞48小時后細胞凋亡率分別為：3.30±0.98、14.97±2.67、27.53±5.51和55.90±5.1%,可見細胞凋亡率隨甘草酸濃度的增加而增加。3、甘草酸處理后,p65蛋白在U251細胞中的表達及分布：蛋白免疫印跡結(jié)果提示p65蛋白在對照組呈較高表達(2.83±0.38),而在甘草酸處理組,p65蛋白表達顯著降低(1.91±0.31,1.43±0.28,0.94±0.22),各甘草酸處理組與對照組的蛋白表達水平在統(tǒng)計學上具有顯著差異(1mM, P0.05;2mM, P0.01;4mM, P0.01)。此外,采用抗p65抗體的免疫熒光結(jié)果顯示對照組細胞核p65的熒光強度較強,而2mmol/L的甘草酸處理48小時后,U251細胞核p65的熒光強度變?nèi)酢?結(jié)論：我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘草酸通過抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡發(fā)揮對人膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞的抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)為甘草酸治療膠質(zhì)瘤的臨床藥物研究提供依據(jù)。除此之外,甘草酸對NF-κB抑制作用為對抗NF-κB相關疾病提供新的治療策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳忠平;腦膠質(zhì)瘤的綜合治療[J];癌癥;2001年04期

2 李誠秀，，黃能慧，李玲，羅俊;甘草甜素對抗癌藥活性及毒性的影響[J];貴陽醫(yī)學院學報;1996年03期

3 于華,葛淑芬,王延高;甘草甜素對小鼠頜下腺纖維肉瘤移植瘤抑制作用的實驗研究[J];華西口腔醫(yī)學雜志;2004年06期

4 張國偉;周杰;廖彩仙;;核轉(zhuǎn)錄因子-κB介導的細胞凋亡在良惡性胰腺組織表達的實驗研究[J];醫(yī)學研究生學報;2008年12期

5 黃煒,黃濟群,張東方,張瑞玲,廖兆全;甘草酸、18β-甘草次酸、熊果酸和齊墩果酸抗人肺癌細胞侵襲作用及其機理的研究[J];中國中醫(yī)藥科技;2003年06期

6 余亞娟,蔣建剛,周云,陳婷;甘草酸二銨對人肺癌細胞A549增殖作用的影響[J];咸寧學院學報(醫(yī)學版);2005年05期

7 王志凌;成軍;張連峰;邵鳳娟;劉蔚;劉妍;陶明亮;;復方甘草甜素下調(diào)細胞周期素依賴性激酶1啟動子表達[J];世界華人消化雜志;2005年19期

8 劉新月,楊海燕,陳開瀾,孫春艷;甘草次酸抑制K562細胞增殖的機制的實驗研究[J];中國醫(yī)院藥學雜志;2005年04期

9 葛淑芬,蘭行簡;甘草甜素對小鼠頜下腺纖維肉瘤細胞的增殖抑制作用[J];中華口腔醫(yī)學雜志;1998年06期

10 黃煒,黃濟群,張東方,廖兆全;維甲酸、甘草酸和18β-甘草次酸抗人肺癌細胞增殖和侵襲的作用[J];中國腫瘤;2003年11期

本文編號：1671715